重组酶RecA与细菌耐药相关性的研究

摘要

细菌耐药已经成为备受世界各国人们关注的问题。由于大部分抗生素是非处方药，个人不合理使用抗生素以及畜牧业抗生素的滥用导致产生大量耐药细菌。耐药细菌的广泛传播给临床感染治疗带来巨大的挑战。细菌耐药从耐单一药物发展成为了耐多种药物，而且多重耐药菌的耐药谱也一直在拓宽，甚至出现了超级细菌。这给世人发出了警示，需要从本质上去揭示细菌耐药的发生与发展机制，这成为了治疗耐药菌感染问题的关键。 本论文在前期研究中发现在能诱导细胞产生氧化自由基的抗生素作用下，细菌只有耐药前期出现基因重组，而细菌耐药后期没有基因重组。能诱导细胞产生氧化自由基的抗生素包括氟喹诺酮类、氨基糖苷类和β-内酰胺类，他们诱导细胞产生氧化自由基，氧化自由基作用于DNA双链，使DNA双链断裂，从而启动SOS修复系统。在SOS修复系统中，直接参与基因重组的是重组酶RecA。那么重组酶RecA与细菌耐药有无关系，临床分离的耐药菌是否会出现基因组重组。 为研究重组酶RecA与细菌耐药相关性，构建了recA缺失株（△recA）和recA回复株（△recA+recA）。分别选取能产生氧化自由基的氟喹诺酮类、氨基糖苷类和β-内酰胺类抗生素中的环丙沙星、庆大霉素和氨苄青霉素持续作用于（驯化）E.coli BW25113野生型菌株（WT）、recA缺失株和recA回复株，分别测定其在培养12小时的最低抑菌浓度（MIC12）。结果表明recA缺失会降低细菌MIC12，而recA基因的回复又一定程度上提升了MIC12，这揭示了recA缺失降低了细菌对能诱导细胞产生氧化自由基的抗生素的耐药性。那么在不同的细菌耐药阶段重组酶RecA的表达量又是怎样变化的？为研究这一问题，提取了环丙沙星、庆大霉素和氨苄青霉素分别作用于E.coli BW25113野生型菌株、recA缺失株和recA回复株10min、1代和25代的全蛋白，经Western blotting检测重组酶RecA的表达量，实验结果显示抗生素作用于细胞后RecA的表达先上升再下降，说明RecA在细菌耐药初期发挥作用。 那么临床上感染的已经进入耐药后期的细菌是否也不会出现基因重组。为了解决这一问题，从临床病人身上分离耐药后期的多药耐药鲍曼不动杆菌，提取其基因组并构建基因组文库，以鲍曼不动杆菌ATCC19606标准菌株基因组作为参考基因组，比较临床多药耐药鲍曼不动杆菌基因组与参考基因组，发现临床多药耐药鲍曼不动杆菌没有基因重组。证明了细菌耐药后期没有基因重组。

目录

声明

第一章前言

1 重组酶A（RecA）

2 大肠杆菌简介

3 鲍曼不动杆菌简介

4 抗生素

5 细菌耐药概况

6基因组大规模测序进展与应用

7 本课题研究思路

第二章技术路线

第三章实验材料和方法

1 实验材料

2 实验方法

第四章 实验结果

1 四大重组系统缺失的DH5α和重组系统完整的BW25113驯化结果揭示细菌耐药可能与recA相关

2 野生型菌株、recA缺失株和recA回复株驯化结果表明recA缺失降低了细菌耐药性

3 不同抗生素处理不同耐药阶段RecA表达量的变化

4 不同抗生素处理不同耐药阶段tRNA的变化情况

5 临床多药耐药鲍曼不动杆菌验证细菌耐药后期不出现基因组重组的假设

第五章 实验讨论

第六章 结论

第七章 展望

参考文献

致谢