结膜下注射人脐带间充质干细胞治疗角膜损伤的实验研究

摘要

角膜盲是一种因角膜失去功能从而导致视功能丧失的眼病。角膜透明无血管，感觉神经非常丰富，任何使角膜透明性、形状、完整性发生变化的角膜疾病，都将导致视力的明显下降。由于角膜位于眼部正前方，在遭受外伤时，角膜最易受到伤害，从而发生破裂、感染或混浊，其最常见的损伤原因是眼表组织的化学性烧伤和热烧伤，常因角膜结构的破坏及角膜新生血管化，而导致视力的严重损害。临床治疗中，角膜移植仍然是目前主要的治疗手段，但角膜供体奇缺、移植片远期存活率低、术后不可避免的免疫排斥反应等，都进一步限制了角膜移植在眼表组织损伤中的应用。来源于人脐带组织的间充质干细胞因获取方便、无创，自我更新，低免疫原性及避免了胚胎干细胞伦理学争议等优点，近年来被广泛应用于临床研究。人脐带间充质干细胞可分化为多种间叶组织细胞，也可在炎症和组织创伤过程中分泌细胞因子促进组织再生，因而在组织和细胞替代治疗及再生医学方面具有极大的应用价值。 本研究中，分别通过体外细胞培养与活体动物两个实验阶段，共同探讨人脐带间充质干细胞（human umbilical cord-derivedmesenchymal stem cells,hUCMSCs）在角膜碱烧伤早期对角膜上皮缺损、角膜混浊、角膜新生血管化、角膜炎症介质释放等方面的修复与治疗作用。 第一部分：人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）的分离培养与鉴定 目的：建立hUCMSCs标准的分离纯化、规模化培养及分化潜能鉴定体系；解决hUCMSCs冻存及复苏中的技术问题；初步建立hUCMSCs混悬制品的质控标准，以便获得足量的细胞满足储存及后期动物实验研究的需要。 方法：无菌分离脐带组织，制成标准大小的组织块，将其置于37℃，5%CO2孵育箱中悬浮培养，待人脐带间充质干细胞贴壁后，于倒置显微镜下行细胞学形态观察和HE染色；PCR技术检测培养获得的hUCMSCs有无支原体污染；应用流式细胞仪分析细胞表面抗原表型；茜素红和油红O染色分别用于成骨和成脂诱导分化后钙质及脂滴的观察鉴定；利用明胶微载体培养系统扩增hUCMSCs，在前期hUCMSCs规模化培养的基础上努力探索5L培养体系的工艺条件、细胞收获方式；通过对hUCMSCs冻存保护剂、冻存方式以及复苏标准流程的确立，从而解决冻存复苏过程中相应的技术问题；CM-Dil染色行脐带间充质干细胞体外标记。 结果：利用组织块悬浮法成功分离培养出人脐带间充质干细胞，且无论从组织学形态，还是支原体检测都符合间充质干细胞的制备标准，细胞可以表达多种抗原表型，如CD73、CD90和CD105；但不表达造血细胞及与移植排斥相关的抗原表型，如CD11b、CD19、CD34、CD45和HLA-DR。在条件培养中可成功诱导分化出骨细胞和脂肪细胞。在明胶微载体培养系统条件下成功扩增出大量的hUCMSCs；进一步建立了hUCMSCs冻存及复苏的标准工艺流程；且hUCMSCs经CM-Dil体外染色标记后，可高表达橘红色荧光。 结论：通过组织块悬浮法可成功分离培养出符合质检标准的人脐带间充质干细胞，并且培养获得的细胞经体外鉴定后，具有间充质干细胞的抗原表型和多向分化的能力；通过微载体培养系统可使得hUCMSCs在体外获得大量扩增；通过对hUCMSCs冻存保护剂、冻存方式以及复苏标准流程的确立，解决了这一过程中相应的技术问题。 第二部分：人脐带间充质干细胞对H2O2诱导的人角膜上皮细胞急性氧化损伤的保护及抗凋亡作用 目的：通过将hUCMSCs与H2O2氧化诱导损伤后的人角膜上皮细胞共培养，观察hUCMSCs能否对损伤后的人角膜上皮细胞起到保护及抗凋亡作用。 方法：液氮管中取出已培养好的人角膜上皮细胞株（SDHCEC），用提前配制好的人角膜上皮细胞专用培养液（每100ml培养液内含EGF100μl；转铁蛋白100μl；胰岛素100μl；氢化可的松100μl；NEAA1ml；Glu1ml；双抗1ml；胎牛血清10ml及高糖DMEM86.6ml）进行优化培养，以保证细胞正常的生长及增殖。待角膜上皮细胞贴壁传代后于倒置显微镜下行形态学及HE染色观察。免疫荧光染色鉴定其表面标记蛋白Cytokeratin3和Cytokeratin12。建立人角膜上皮细胞的H2O2氧化诱导损伤模型，于倒置显微镜下观察诱导前后人角膜上皮细胞的形态学变化和老化情况。死活细胞染色检测诱导损伤前后角膜上皮细胞的死活比例。流式细胞仪检测氧化损伤的人角膜上皮细胞与hUCMSCs在Transwell共培养24h前后，各组细胞的凋亡比例、活性氧含量及线粒体膜电位的变化情况。ELISA检测共培养前后生长因子（EGF和bFGF）的表达情况。 结果：通过使用人角膜上皮细胞的专用培养液进行优化培养后，倒置显微镜下观察发现，多次传代后的人角膜上皮细胞没有因为传代次数的增多，而出现衰老的迹象，相反仍能保持正常的生长状态。培养获得的人角膜上皮细胞经体外鉴定后，能够表达其特有的蛋白标志物CK3和CK12。利用1mM H2O2进行人角膜上皮细胞氧化诱导24h后发现，细胞存活率可降低至50%，且细胞形态和数量较诱导前有明显的改变。行β-半乳糖苷酶染色后可在镜下观察到氧化诱导模型组的人角膜上皮细胞出现衰老的蓝染颗粒凝集。且经死活细胞染色观察后发现，H2O2氧化诱导损伤模型组死亡和破裂的人角膜上皮细胞数量较诱导前显著增多。与hUCMSCs行Transwell共培养24h后，人角膜上皮细胞的凋亡比例、活性氧含量较共培养前显著减少，同时线粒体膜电位与共培养前相比也有明显的上调，且各项差异均具有统计学意义，分别为细胞凋亡检测（t=15.75，p=0.00），活性氧检测（t=57.71，p=0.00），线粒体膜电位检测（t=-3.258，p=0.031）。经ELISA检测EGF和bFGF的含量后发现，人角膜上皮细胞与hUCMSCs共培养24h后，其细胞液内EGF和bFGF含量较共培养前明显增加，差异同样具有统计学意义，分别为EGF（t=-58.291，p=0.00），bFGF（t=-10.272，p=0.01）。 结论：通过共培养的方式，hUCMSCs可对H2O2诱导氧化损伤后的人角膜上皮细胞起到保护和抗凋亡作用，推测hUCMSCs发挥作用的方式可能是通过旁分泌某些营养因子以促进损伤细胞修复和再生。 第三部分：结膜下注射人脐带间充质干细胞对兔角膜碱烧伤的修复和治疗作用 目的：通过对碱烧伤后的术眼行结膜下人脐带间充质干细胞注射，观察人脐带间充质干细胞能否对兔角膜碱烧伤早期起到修复和治疗作用。 方法：建立兔角膜急性碱烧伤模型，荧光素钠染色观察角膜上皮损伤面积，HE染色确定损伤深度。将前期制备好的hUCMSCs混悬液和同型阴性对照组溶媒液，行实验造模眼结膜下注射，于微距及裂隙灯下进行为期2周的动态观察，对比hUCMSCs注射组和对照组术眼的角膜上皮愈合面积、角膜透明度、角膜新生血管（CNV）、前房、结膜充血、睫状充血和眼部分泌物等情况。HE染色观察各组角膜上皮的愈合情况，免疫组织化学染色观察各组角膜上皮标志蛋白（CK3和CK12）和角膜上皮修复相关蛋白（α-SMA和Ki-67）的表达情况。酶联免疫法检测各组房水中炎症因子（TNF-α和IL-1β）的表达情况，以及各组角膜组织匀浆上清液中血管内皮生长因子（VEGF），表皮生长因子（EGF）和角质细胞生长因子（KGF-2）的表达情况。 结果：成功建立兔角膜急性碱烧伤模型。微距及裂隙灯下观察发现，经hUCMSCs混悬液注射后的实验组相比同型阴性对照组和空白对照组，其眼部各项指标，即角膜上皮愈合面积、透明度、角膜新生血管和前房情况等都得到了明显的改善。于造模术后第7天，HE染色观察发现，hUCMSCs注射组角膜上皮已修复完全，仅存留轻度的基质水肿，而对照两组在水肿的角膜基质层可见到大量炎性细胞浸润和纤维组织增生。免疫组织化学染色观察发现，各组角膜都可表达CK3和CK12，其中hUCMSCs注射组角膜上皮增殖蛋白Ki-67表达阳性，对照组为阴性。hUCMSCs注射组基质纤维化蛋白α-SMA未见表达，而对照组α-SMA表达阳性，说明对照组角膜基质存在纤维化修复。酶联免疫法检测各组房水后发现，hUCMSCs注射组TNF-α和IL-1β表达量均明显低于对照两组，差异具有统计学意义，p=0.00。检测各组角膜组织匀浆上清液后发现，hUCMSCs注射组VEGF的含量明显低于对照两组，EGF和KGF-2的含量则明显高于对照两组，且差异均具有统计学意义，p=0.00。 结论：首次利用结膜下注射hUCMSCs的方式，能在碱烧伤早期对术眼角膜起到修复和治疗作用，推测hUCMSCs发挥作用的方式可能是通过其在损伤部位抑制了炎症介质的释放及VEGF的生成，并通过旁分泌某些营养因子（EGF和KGF-2）以促进了损伤组织的修复和重塑。

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