唇腭裂相关基因MID1/MID2的细胞内分子功能研究

摘要

唇腭裂即是由于颜面部胚胎发育早期单侧或双侧中鼻突和左右上颌突的增生速度不协调，三者不能同时到达中线，或者在中线上融合过程发生障碍，从而导致单侧或双侧唇腭裂。从细胞水平上看，颜面部早期发育是一个融合了包括细胞增殖，识别，凋亡和细胞EMT转化的复杂过程。唇腭裂可以单独发生（单纯型）或合并有其它器官的发育缺陷（综合征型），是基因与环境因素相互作用的结果。目前已知有多个基因参与颜面部早期发育调控，其中MID1是综合征型唇腭裂（Opitz综合征）的致病基因，其基因突变被认为是导致X连锁的Opitz综合征的分子遗传学基础，其突变也在散发的单纯型唇腭裂中被报导，因此认为其参与了颜面部早期发育的基因调控。研究发现MID1编码一个与微管结合的E3泛素连接酶，通过其主要结合因子Alpha4而影响细胞内PP2A的泛素化降解。MID1有一个同源物MID2，两者编码的蛋白质同为RBCC蛋白，同源性高达85%，MID2同样与细胞内微管结合，可与MID1形成二聚体。MID2同样结合Alpha4，也具有潜在的泛素连接酶活性。 目的：研究MID1和MID2在细胞内分子功能的相似和区别，探究MID1及MID2基因对细胞的增殖、移行、凋亡以及EMT影响，以及MID1/MID2发挥其细胞效应的信号通路。 方法：1.在培养细胞中，利用MID1/MID2真核表达载体和MID1/MID2基因的特异性的siRNA过表达或沉默靶基因；2.划痕法检测MID1/MID2基因过表达或抑制后对细胞迁移的影响；3.CCK-8试剂盒检测MID1/MID2基因过表达或抑制后对细胞增殖的影响；4.流式细胞仪检测MID1/MID2基因过表达或抑制后对细胞凋亡的影响；5.利用荧光素酶报告基因表达系统及Western-blot技术检测检测MID1/MID2基因对细胞内WNT信号通路中β-catenin水平的影响。6.免疫共荧光技术及Western-blot技术检测MID1/MID2基因对细胞EMT标志分子E-cadherin和vimentin的表达影响；7.用western blot检测细胞内总PP2A和磷酸化PP2A的水平，确定MID1/MID2的作用机制。并利用PP2A特异性抑制剂来检测MID1/MID2的细胞效应是否是通过调控其关键下游分子PP2A来实现。 结果：1.CCK-8检测到MID1/MID2过表达时细胞增殖增强，MID1/MID2沉默后细胞增殖被抑制；2.过表达MID1/MID2抑制细胞移行而沉默MID1/MID2促进细胞移行；3.MID1/MID2沉默促进细胞凋亡；4.双荧光素酶报告基因系统检测了MID1和MID2对细胞内WNT信号通路的影响，结果显示MID1和MID2能够抑制细胞内WNT信号通路的活性，相应的western blot结果也显示过表达MID1/MID2下调了细胞内WNT信号通路下游的关键效应分子β-catenin的水平。5.免疫荧光结合共聚焦显微镜结果显示沉默MID1、MID2可下调E-Cadherin的表达同时上调细胞内vimentin的表达，从而促进EMT的发生。6.本次研究所涉及的实验中MID2和MID1表现出相似的分子功能和细胞效应，提示两者功能互补。 结论：MID2和MID1结构相似，功能互补。抑制MID1和MID2对细胞内PP2A的水平无明显影响，但显著降低PP2A的磷酸化，并进一步促进WNT信号通路的活性，升高细胞内β-catenin的水平，并显著下调细胞内E-Cadherin上调Vimentin的表达而促进EMT的发生，促进细胞移行。另外，MID1和MID2还促进细胞增殖和凋亡。

目录

声明

英文缩略词表

第一章前言

1.唇腭裂概况

2.颜面部的早期发育和唇腭裂的病理发生

3.颜面部早期胚胎发育的主要信号通路

4.MID1基因和Opitz综合征

5.MID1、MID2基因潜在的分子功能

研究目的及意义

第二章实验材料与方法

实验材料

实验方法

第三章MID1/MID2过表达载体和siRNA的构建及筛选

实验结果

讨论

第四章 MID1和MID2的细胞内信号通路

实验结果

讨论：

第五章 MID1和MID2潜在的细胞功能

实验结果

讨论：

第六章 MID1和MID2对早期颜面部胚胎发育的影响

实验结果

讨论：

第七章讨论与展望

1. 讨论

2. 展望

3. 结论

参考文献

附录

致谢