小檗碱增强丝裂霉素诱导膀胱癌T24细胞周期阻滞及凋亡的作用机制

摘要

目的： 研究小檗碱（Berberine，Ber）增强丝裂霉素（Mitomycin C，MMC）诱导人类膀胱癌T24细胞周期阻滞及细胞凋亡的作用及其相关机制。 方法： 实验将膀胱癌T24细胞分成4组，分别是对照组（Control，Con），丝裂霉素组（MMC），丝裂霉素联合小檗碱组（MMC+Ber），小檗碱组(Ber)，采用CCK-8法检测细胞的活力，检测不同药物处理后膀胱癌T24细胞增殖率。使用流式细胞仪分析不同药物处理后膀胱癌T24细胞细胞周期的分布情况，并用Western-blot蛋白免疫印迹法测定p21、p27、CynlinD1、CDK2、CDK4、Survivin蛋白的表达水平。并采用Annexin V-FITC/PI双染色法检测不同药物处理后T24细胞的凋亡率。 结果： 1.使用CCK-8法测定不同浓度的小檗碱（0.5，1.0，2.0μmol/L）、丝裂霉素（150.0μmol/L）联合和分别处理膀胱癌T24细胞24、48小时后，结果显示，加药处理24h后，以对照组细胞存活率为100%计算，MMC组细胞增殖率为49.51%、MMC+Ber组的细胞增殖率为41.21%～43.29%。而加药处理48h后,MMC组细胞增殖率为38.68%，MMC+Ber组的细胞增殖率为27.68%～29.23%。结果提示MMC+Ber组对膀胱癌T24细胞的增殖抑制作用较单用MMC组更加明显（P＜0.05），而且具有时间依赖性（P＜0.05），但是其协同效应与小檗碱的浓度并无明显依赖性。根据以上结果和相关文献，进一步确定实验所需小檗碱的浓度为1.0μmol/L，后续实验中小檗碱浓度均为1.0μmol/L。 2.采用Annexin V/PI双染色法检测T24细胞的凋亡率，不同药物处理膀胱癌T24细胞后，其总凋亡细胞所占比例如下：3.56±1.102%（Con）、15.30±1.587%（MMC，vs Con P＜0.01），29.167±3.383%（MMC＋Ber，vs MMC P＜0.05），6.433±1.222%（BER）。MMC＋Ber组的细胞凋亡相比单用药物组更加明显，这些数据表明，Ber能促进MMC诱导T24细胞凋亡。 3.使用流式细胞仪检测不同药物处理膀胱癌T24细胞后细胞周期分布的情况，结果提示，MMC＋Ber组的G0/G1期细胞所占比例增高，与单用MMC组及对照组比较有明显差异(P＜0.05)。 4.Western blot法检测结果显示，Ber联合MMC药物组上调细胞周期依赖性激酶抑制蛋白p21、p27蛋白的表达水平，同时下调Cyclin D1、CDK-2及CDK-4细胞周期相关蛋白及凋亡抑制蛋白Survivin的表达。 结论： 小檗碱能增强丝裂霉素抑制T24细胞的增殖，且具有时间依赖性。小檗碱能增强丝裂霉素促进膀胱癌T24细胞G0/G1期细胞周期阻滞及细胞凋亡，其机制可能是通过上调p21及p27，抑制Cyclin D1、CDK-2和CDK-4，导致细胞阻滞在G0/G1期，抑制Survivin蛋白的表达，促进细胞凋亡。

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