驱蛲虫药扑蛲灵在BCR-ABL-T315I突变的CML细胞中抗肿瘤活性的研究

摘要

慢性粒细胞性白血病（chronic myeloid leukemia，CML）是一种由于造血系统异常引起骨髓造血功能紊乱而产生大量分布于骨髓、外周血的未成熟的血液细胞的全身性疾病。CML是常见的血液恶性肿瘤。在美国，发病率为每10万人中有1.8人患CML。2016年，新增CML病例高达8000多人。CML病人在临床上的发病阶段，可以分为慢性期（chronic phase,CP）、加速期（accelerated phase,AP）及危象期（blast crisis,BP）。其中，大部分患者在慢性期可得到确诊。已发现的CML患者中，均伴随有BCR-ABL基因阳性表达。BCR-ABL基因是由于第9号染色体的ABL基因易位到22号染色体的BCR基因下游而形成的融合基因，融合后的BCR-ABL基因会使酪氨酸激酶异常激活，导致骨髓造血干细胞恶性转化而引发CML。目前临床上针对BCR-ABL融合基因突变的酪氨酸激酶抑制剂主要有imatinib、dasatinib及nilotinib等，这些药物能有效地改善费城染色体阳性病人的生活质量、延长病人的生存期，然而，大量的临床研究发现，长期服用imatinib的CML患者，会有不同程度的耐药现象发生。经基因检测发现，大部分发生耐药的病人体内的BCR-ABL融合基因均发生不同位点的突变（如T315I,G250E,Q252H,Y253H,E255K/V等）。尽管经过改进的二代酪氨酸激酶抑制剂可以克服大部分基因突变引起的耐药，但对携带BCR-ABL-T315I突变的患者却无效。目前，T315I突变是CML中最严重的一种耐药突变，只能通过骨髓移植来治疗。近年来，开发的第三代酪氨酸激酶抑制剂（如ponatinib）虽然可以在一定程度上延长BCR-ABL-T315I突变患者的生存时间。然而，随着在临床试验的大量使用，发现其具有严重的心血管毒性，所以FDA于2013年明确限制其临床应用。因此，寻找新的靶向或广谱治疗CML的高效低毒药物迫在眉睫，尤其是寻找针对BCR-ABL-T315I突变的CML的治疗药物更加迫切。 扑蛲灵（pyrvinium pamoate）是由FDA批准用于治疗蛲虫病的传统驱虫药，临床毒性较小。近年来，大量的研究表明，扑蛲灵具有明显的抗肿瘤活性，而对正常细胞几乎无毒副作用，扑蛲灵是否具有抗BCR-ABL-T315I突变的CML的细胞活性目前仍不清楚。因此，本课题围绕扑蛲灵是否具有抗BCR-ABL-T315I突变的CML的活性展开研究，为开发传统药物扑蛲灵新的适应症提供理论和实验依据，也为imatinib耐受的CML的治疗提供新的药物。 目的： 1.研究传统驱虫药扑蛲灵对imatinib耐受的CML细胞的抑制效应及其作用机制。 2.为传统驱虫药扑蛲灵老药新用提供理论和实验依据。 方法： 1.MTS法及软琼脂克隆形成实验（soft agar colony formation assay）观察扑蛲灵对BCR-ABL阳性细胞K562、KBM5、KBM5-T315I、32D-BCR-ABL及32D-T315I增殖能力的影响。 2.采用台盼蓝计数统计扑蛲灵对BCR-ABL阳性细胞K562、KBM5、KBM5-T315I、32D-BCR-ABL及32D-T315I死亡率的影响，同时采用western blotting检测扑蛲灵对BCR-ABL阳性细胞的凋亡标志性蛋白、凋亡相关蛋白和胞浆内AIF及细胞色素C的释放的影响。 3.Western blotting检测扑蛲灵对BCR-ABL阳性细胞中Wnt/β-catenin信号通路的影响。 结果： 1.扑蛲灵可明显抑制BCR-ABL阳性细胞K562、KBM5、KBM5-T315I、32D-BCR-ABL及32D-T315I增殖和克隆形成能力且呈剂量依赖性，其IC50值分别为61.2nM、26.2nM、29.2nM、49.7nM和133nM。 2.扑蛲灵可显著促进BCR-ABL阳性细胞K562、KBM5、KBM5-T315I、32D-BCR-ABL及32D-T315I凋亡，特异性激活凋亡蛋白Caspase-9、Caspase-8、Caspase-3，进而激活下游PARP，诱导凋亡发生。扑蛲灵降低抗凋亡蛋白Mcl-1、XIAP、Survivin的表达水平，对其他的凋亡相关蛋白没有明显的作用。扑蛲灵可破坏线粒体膜的通透性，引起凋亡诱导因子（AIF）和细胞色素C释放到胞浆，引起细胞的程序性死亡。 3.扑蛲灵显著降低BCR-ABL阳性细胞K562、KBM5、KBM5-T315I、32D-BCR-ABL及32D-T315I细胞中β-catenin的表达，显著阻断β-catenin的入核，因此推测扑蛲灵可能通过抑制经典的Wnt/β-catenin信号通路发挥对BCR-ABL阳性细胞的抑制效应。 结论： 1.扑蛲灵能有效地抑制BCR-ABL阳性细胞的增殖。 2.扑蛲灵可能通过内源性线粒体途径诱导BCR-ABL阳性细胞发生凋亡。 3.扑蛲灵可能抑制经典的Wnt/β-catenin信号通路。

目录

声明

英文缩略词

1 前言

1.1慢性粒细胞性白血病

1.2 慢性粒细胞性白血病的发病机制及治疗

1.2.1 BCR-ABL基因及BCR-ABL信号通路

1.2.2 BCR-ABL基因的突变

1.3 Wnt/β-catenin信号通路在肿瘤发生发展中的作用。

1.4扑蛲灵

1.5科学问题和创新之处

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 主要实验仪器

2.1.2 主要实验试剂

2.1.3 实验抗体

2.1.4 主要实验试剂的配制

2.2 实验方法

2.2.1 细胞培养

2.2.2 蛋白免疫印迹法（Western blotting）

2.2.3 细胞活力测定

2.2.4 台盼蓝拒染

2.2.5 软琼脂克隆形成实验

2.2. 6 统计分析

3 实验结果

3.1 扑蛲灵能够明显地抑制CML细胞尤其是T315I突变的细胞的增殖

3.2 扑蛲灵可以显著诱导BCR-ABL阳性细胞发生凋亡

3.3 扑蛲灵在BCR-ABL阳性表达的细胞中对其他凋亡相关蛋白的作用

3.4 扑蛲灵通过内源性线粒体途径诱导BCR-ABL阳性表达的细胞发生凋亡

3.5 扑蛲灵不影响传统的BCR-ABL信号通路

3.6 扑蛲灵阻断了经典的Wnt/β-catenin信号通路

3.7 扑蛲灵影响β-catenin亚细胞定位

4 讨论

参考文献

研究生就读期间发表论文情况

致谢