利玛原甲藻三个ABC转运蛋白全长cDNA序列的获取及其在不同环境条件下的表达分析

摘要

（ATP-binding cassette transporters，ABC）广泛存在于所有生命体中，包括8个亚家族，在次生代谢物、外源异生物质的跨膜转运以及代谢解毒与植物抗自毒等方面具有重要功能。作为单细胞海洋生物，海洋微藻常常暴露在含有外源有毒有害物质的水环境中，推测，微藻中广泛存在ABC转运蛋白，其在对抗和适应水体中有毒有害物质和抗自毒过程可能发挥重要作用。利玛原甲藻（Prorocentrum lima）是一种典型的底栖产毒甲藻，可产生大田软海绵酸（Okadaic acid,OA）组毒素，其毒素OA的合成以及转运机制尚不明确。 为了解甲藻ABC转运蛋白的结构和可能的作用，本文以利玛原甲藻为研究对象，采用本地blast和RACE克隆技术获得利玛原甲藻ABCB1、ABCG2和ABCC1基因全长cDNA序列。其中，ABCB1cDNA全长为3951bp，含有一个长度为3834bp的开放阅读框（open reading frame,ORF），编码一个具有1277个氨基酸残基的蛋白，是一个全结构（full structure）跨膜蛋白；ABCG2cDNA全长为2404bp，含有一个长度为1878bp的开放阅读框，编码一个具有625个氨基酸残基的蛋白，是一个半结构（half structure）跨膜蛋白；ABCC1cDNA全长为4259bp，含有一个长度为4098bp的开放阅读框，编码一个具有1365个氨基酸残基的蛋白，是一个全结构跨膜蛋白。生物信息学分析显示，所获得的利玛原甲藻ABCB1、ABCG2和ABCC1均符合各自亚家族蛋白的典型结构特征。 为进一步了解环境因素对利玛原甲藻毒素OA生成和ABC转运蛋白表达的调控作用，本文测定了不同氮源（或磷源）、氮磷限制、重金属（Cu2+,三丁基氯化锡）污染和卤虫摄食压力下利玛原甲藻中OA的合成、三种ABC转运蛋白的表达情况。结果发现，缺氮和缺磷时均可促进利玛原甲藻中毒素OA的生成，不同氮源和磷源对利玛原甲藻毒素生成的影响不同。一定浓度的Cu2+可促进利玛原甲藻OA的生成，但三丁基氯化锡（tributyltin chloride,TBT）却能显著抑制OA的生成。摄食压力下，利玛原甲藻中OA的合成显著增加。ABCB1、ABCG2和ABCC1的表达受环境因素影响很大。缺氮和缺磷可促进利玛原甲藻中ABCB1和ABCG2的表达。不同氮源和磷源下，利玛原甲藻中ABCB1、ABCG2和ABCC1的表达不尽相同。较高浓度的Cu2+胁迫下，利玛原甲藻中ABCB1、ABCG2和ABCC1的表达发生上调，提示这些ABC转运蛋白可能参与了利玛原甲藻中重金属解毒作用。另外，卤虫摄食压力下，ABCB1和ABCG2的表达发生上调。不同环境条件下，利玛原甲藻毒素OA的生成不同，同时ABCB1、ABCG2和ABCC1基因的表达也存在很大差异，但两者的变化并不一致，OA的合成与这三种蛋白之间的表达并不存在明显的关联性，推测OA的转运可能是一个非常复杂的生理过程。

目录

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英文缩写词

第一章 前言

1.1 ABC转运蛋白

1.1.1 ABC转运蛋白及其结构特征

1.1.2 植物ABC转运蛋白及其功能

1.1.3 藻类中ABC转运蛋白的研究

1.2 利玛原甲藻及其次生代谢物

1.2.1 利玛原甲藻

1.2.2 DSP毒素及其毒性

1.2.3 影响毒素生成的因素

1.2.2 其他次级代谢产物

1.3 本研究的目的和意义

1.4 本研究的创新点

第二章 利玛原甲藻ABC转运蛋白cDNA全长序列的获取

2.1 实验材料

2.1.1 实验藻

2.1.2 主要仪器和试剂

2.2 实验方法

2.2.1 利玛原甲藻的培养

2.2.2 利玛原甲藻总RNA的提取

2.2.3 目的基因序列的获取

2.2.4 引物设计

2.2.5 5’RACE

2.2.6 目的cDNA全长的生物信息学分析

2.3 结果

2.3.1 利玛原甲藻ABCB1基因的全长cDNA及其蛋白特征分析

2.3.2 利玛原甲藻ABCG2基因的全长cDNA及其蛋白特征分析

2.3.3 利玛原甲藻ABCC1基因的全长cDNA及其蛋白特征分析

2.4 讨论

第三章 不同环境条件下利玛原甲藻ABC转运蛋白的表达与毒素OA的生成

3.1 实验材料

3.1.1 实验藻

3.2. 实验方法

3.2.1 藻的培养

3.2.2 OA含量的测定

3.2.3 qRT-PCR分析

3.2.4 统计学分析

3.3 结果

3.3.1 不同营养条件下利玛原甲藻的生长、毒素的生成与ABC转运蛋白的表达

3.3.2 不同氮源对利玛原甲藻生长、毒素生成与ABC转运蛋白表达的影响

3.3.3 不同磷源对利玛原甲藻生长、毒素生成与ABC转运蛋白表达的影响

3.3.4 重金属胁迫对利玛原甲藻生长、毒素生成与ABC转运蛋白表达的影响

3.3.5 摄食压力对利玛原甲藻毒素生成与ABC转运蛋白表达的影响

3.4 讨论

第四章 结论与展望

4.1 结论

4.2 展望

参考文献

附录

在校期间发表论文

致谢