血浆TSP-1标记恩度诱导的结直肠癌血管正常化时间窗的研究

摘要

目的：利用恩度（重组人内皮抑素）诱导人结直肠癌血管正常化时间窗的产生，同时分析血浆血小板反应蛋白1（thrombospondin1，TSP-1）的浓度变化与时间窗的相关性并初步探讨其机制，明确TSP-1是否可作为全新的生物标志物监测肿瘤血管正常化时间窗。 方法：利用人结直肠癌细胞SW620(5×106个细胞/只)，于BALB/c雌性（nu/nu）小鼠（4周龄）右侧腹股沟内侧皮下注射进行造模，造模前随机取6只裸鼠采集血浆并通过ELISA检测TSP-1浓度作为基础值。肿瘤体积达到75mm3时再次随机取3只裸鼠采集血浆以动态观测TSP-1浓度。待肿瘤体积达到100mm3-150mm3时开始进行药物干预（实验记为第0天），实验组为重组人内皮抑素（5mg/kg）腹腔注射，对照组注射等量生理盐水（NS），首先连续给药4天，之后每2天给药一次至第12天，分别在第0、2、4、6、12天采集血浆和肿瘤组织及肝肾组织，通过免疫组化、免疫荧光、HE染色分析肿瘤血管正常化时间窗的产生及肿瘤组织内部含氧量变化的情况，通过肝肾组织HE染色明确恩度的脏器毒性情况，并进一步分析血浆TSP-1的变化与人结直肠癌血管正常化时间窗的关系。 结果：利用恩度进行抗血管生成治疗，肿瘤血管的成熟度（血管周细胞标记物αSMA+/血管标记物CD31+）在用药第4天至第6天与实验组其他时间段相比明显提高（p＜0.001），对照组未显示出肿瘤血管成熟度变化关系；在对照组中，随着时间的增加，肿瘤组织内部缺氧及坏死情况逐渐加重（p＜0.001），但在实验组当中，用药第4天至第6天肿瘤组织内部缺氧及坏死情况较第0天及第12天有改善，尤其以第6天明显（p＜0.001），同时，通过分析肿瘤组织内缺氧诱导因子HIF-1α的表达，实验组中第4天和第6天其表达量较第0天、第12天降低明显（p＜0.05）；血浆TSP-1与血管正常化的时间窗具有相关性，在时间窗内表现为血浆TSP-1浓度降低，与生理盐水组相比有统计学差异（P＜0.05），同时在用药始末，裸鼠肝肾结构未见明显改变。 结论：恩度可使结直肠癌血管正常化；血浆TSP-1在肿瘤组织缺氧加重时升高，而在缺氧改善的肿瘤血管正常化时间窗内降低，可作为一种全新的生物标志物监测肿瘤血管正常化时间窗。

目录

声明

前言

材料与方法

1. 实验细胞种类及器械与试剂

1.1 肿瘤细胞系及裸鼠来源

1.2 主要试剂

1.3 相关实验所需器材

1.4 常用试剂的制配方法

2．实验方法

2.1 SW620肿瘤细胞培养

2.2 裸鼠皮下SW620移植瘤构建及血浆、组织采取实验干预方案

2.3 肿瘤组织免疫组化步骤

2.4 肿瘤组织免疫荧光步骤

2.5 哌莫硝唑染色分析瘤组织缺氧情况

2.6 瘤组织HE染色明确组织坏死及器官结构变化

2.7 蛋白印迹实验检测瘤组织HIF-α表达情况

2.8 血浆TSP-1的检测

2.9 CCK-8实验明确恩度对SW620细胞活性影响

3. 统计学处理

结果

1.恩度诱导SW620肿瘤血管正常化

1.1恩度抑制肿瘤血管生成

1.2恩度提高肿瘤血管的周细胞覆盖

1.3 恩度处理后可提高肿瘤血管成熟度

2. 肿瘤血管正常化时间窗内缺氧改善，瘤组织内部坏死减轻

2.1 恩度改善瘤组织内部乏氧情况

2.2 肿瘤组织缺氧改善时HIF-1α降低

2.3 肿瘤组织缺氧改善减少局部组织坏死

3.肿瘤血管从“异常-正常-异常”的变化，血浆TSP-1伴随展现出动态变化

3.1 肿瘤组织缺氧改善时血浆TSP-1降低，缺氧加重时升高

3.2 恩度对裸鼠肝肾未见明显毒副作用，不影响SW620活性

讨论

结论

本研究创新点

本研究的局限性

参考文献

缩略词

附录

附录一：在学期间发表文章

附录二：参加学术会议情况

附录三：参与导师研究课题

致谢