高通量低功率氦氖激光照射诱导细胞凋亡的分子机制研究

摘要

低功率激光照射能够引起多种生物刺激效应，包括细胞增殖，分化以及细胞凋亡。然而到目前为止，关于低功率激光照射，尤其在较高的激光剂量时引起的细胞层面的分子机制还不是很清楚。为了研究高通量低功率激光照射诱导细胞凋亡的分子机制，我们使用氦氖激光器在633 nm的波长，80 J/cm2或者120 J/cm2的通量下分别对人肺腺癌细胞（human lung adenocarcinoma cells，ASTC-a-1）和猴肾成纤维细胞（African green monkey SV40-transformed kidney fibroblast cells，COS-7）进行激光照射处理。我们通过监测活细胞内分子探针H2DCFDA的氧化产物DCF的荧光强度来反映细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）的动态产生过程。我们通过检测细胞内分子探针rhodamine 123的荧光强度变化来反映线粒体膜电位的变化。通过使用荧光共振能量转移技术（fluorescence resonance energy transfer，FRET），我们在表达SCAT3报告子的细胞内监测Caspase-3的活性变化。Caspase-8活性的监测是通过观察Bid-CFP荧光报告子的亚细胞定位来实现的。在高通量低功率激光照射诱导的细胞凋亡过程中（120J/cm2，ASTC-a-1），我们观测发现了以下级联的细胞事件：（1）激光照射后细胞内ROS的水平迅速升高，并在60 min之内达到最大值。（2）线粒体膜电位的降低发生在激光照射后15 min的时候，并在50 min的时候达到最低值。（3）Caspase-3的活化维持在激光照射后30～180 min之内。我们的实验结果还表明高通量低功率激光照射不激活死亡受体通路的关键蛋白水解酶Caspase-8，这表明该凋亡过程直接起始于线粒体ROS的产生和膜电位的降低，不依赖于Caspase-8的活化。总之，高通量低功率激光照射诱导细胞凋亡通过触发内源线粒体途径，而不是死亡受体途径。
　　 前面的研究证明高通量低功率激光照射可以通过激活线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡。接下来我们在ASTC-a-1中研究高通量低功率激光照射（120 J/cm2，633 nm）诱导细胞凋亡中线粒体通路的具体机制。我们发现高通量低功率激光照射引起细胞色素c释放是由于线触发了粒体内膜通透性转运孔道（mitochondrial permeability transition pores，MPT pores）的长时间开放所导致的，因为我们发现MPT孔道的特异性抑制剂环孢菌素A（cyclosporine，CsA）阻止了细胞色素c的释放。另外，线粒体对在生理状态下线粒体非通透的钙黄绿素的通透性增加也是高通量低功率激光照射触发MPT的另一个有利证据。高通量低功率激光照射处理后，细胞内立刻监测到大量的ROS的产生。这种由于激光照射触发的光动力反应的产物ROS能够触发MPT孔道的长时间开放，因为ROS清除剂维生素c阻止了这一过程。另外，我们的实验结果显示CsA并没有完全阻止高通量低功率激光照射诱导的细胞凋亡，说明在该凋亡过程中存在除了MPT之外其他的信号通路。我们发现，激光照射后Bax的活化发生在线粒体去极化以及细胞色素c释放之后，这说明Bax的活化是一个下游的凋亡事件。在CsA存在的情况下，Bax在凋亡的后期仍然被激活，这表明Bax介导的信号通路不依赖于MPT。在高通量低功率激光照射处理后，维生素c，CsA，以及Bax沉默对细胞活力的影响实验表明MPT介导的信号通路是主要的，而Bax介导的信号通路是次要的。值得说明的是这两条信号通路都是由大量的ROS的产生触发的。总之，我们的结果表明高通量低功率激光照射通过触发ROS产生进而导致CsA敏感的MPT孔道的长时间开放来诱导细胞凋亡。与此同时，高通量低功率激光照射还诱导了一条由Bax活化介导的次要信号通路。因此，我们阐明的MPT与ROS之间的关系是高通量低功率激光照射诱导细胞凋亡的一个重要的基础。
　　 线粒体是一个动态的细胞器，它持续进行着分裂和融合两个过程以维持其形态和功能的完整。然而到目前为止，关于线粒体融合与分裂的具体机制还不是很清楚。本文我们还研究了由高通量低功率激光照射触发线粒体氧应激诱导的线粒体动态变化异常的机制。在高通量低功率激光照射下，我们发现线粒体呈现过度的片段化结构。且该片段化可以被ROS清除剂维生素c所抑制。进一步的研究表明，高通量低功率激光照射诱导线粒体片段化是通过对融合过程的抑制和对分裂过程的促进两个方面来实现。具体来说，激光照射后，与线粒体稳定结合的促分裂蛋白Drp1（dynamin-related protein 1）大量增加，说明高通量低功率激光照射可以激活Drp1。值得说明的是，过表达Drp1增加了高通量低功率激光照射引起的线粒体片段化的程度并通过促进细胞色素c的释放加速凋亡过程。而过表达促融合蛋白Mfn2（Mitofusin 2）起到完全相反的效应。另外，过表达Drp1和Mfn2对线粒体ROS的产生和线粒体去极化都没有影响。因此，高通量低功率激光照射通过调节Drp1和Mfn2的活性进而打破线粒体分裂/融合的平衡，最终导致线粒体片段化以及线粒体与细胞功能的异常。
　　 总之，我们深入研究了高通量低功率激光照射诱导细胞凋亡的线粒体凋亡途径的具体分子机制：激光通过选择性激发线粒体内源光敏分子而导致大量ROS的产生。线粒体内ROS的大量产生首先造成了线粒体内膜MPT孔道的长时间开放，进而导致线粒体内膜的通透化以及后序的外膜通透化。促凋亡因子如细胞色素c从线粒体释放到细胞质中会导致下游Caspase-3的活化，并最终导致细胞凋亡。另外线粒体ROS的产生通过调节融合/分裂蛋白的活性造成线粒体动态结构变化的异常，并最终导致线粒体片段。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1．1 低功率激光照射的研究进展

1．1．1 激光的生物学效应

1．1．2 激光治疗

1．2 低功率激光照射对生物体的作用

1．2．1 增强机体免疫功能

1．2．2 提升血液循环

1．2．3 改善神经系统

1．2．4 促进细胞增殖

1．2．5 临床应用

1．3 低功率激光生物刺激效应的特点和机理

1．3．1 低功率激光生物刺激效应的特点

1．3．2 低功率激光生物刺激效应的机理

1．4 单分子荧光成像技术的原理及其应用

1．4．1 激光扫描共聚焦显微镜

1．4．2 荧光共振能量转移技术

第二章 细胞凋亡的研究进展

2．1 细胞死亡方式的分类

2．2 细胞凋亡

2．2．1 定义

2．2．2 死亡受体通路

2．2．3 线粒体通路

2．2．4 Bcl—2家族

2．2．5 临床意义

第三章 高通量低功率激光照射激活线粒体凋亡通路

3．1 引言

3．2 实验材料和方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验方法

3．3 实验结果

3．3．1 活性氧的产生

3．3．2 线粒体去极化

3．3．3 HF—LPLI激活Caspase—3

3．3．4 HF—LPLI不激活Caspase—8

3．4 讨论

3．5 结论

第四章 高通量低功率激光照射触发线粒体通透性转运过程

4．1 引言

4．2 实验材料与方法

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验方法

4．3 实验结果

4．3．1 HF—LPLI诱导MPT过程

4．3．2 ROS介导HF—LPLI引起的细胞凋亡

4．3．3 Vit C抑制了HF—LPLI诱导的MPT过程

4．3．4 CsA延缓HF—LPLI引起的线粒体去极化

4．3．5 CsA延缓HF—LPLI引起的细胞色素c释放

4．3．6 HF—LPLI促进Bax的活化

4．3．7 维生素c，Bax沉默，环孢菌素A对细胞凋亡的保护作用

讨论

4．4 结论

第五章 高通量低功率激光照射诱导线粒体片段化

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 实验材料

5．2．2 实验方法

5．3 结果

5．3．1 HF—LPLI通过引起线粒体氧化应激诱导线粒体片段化．68

5．3．2 HF—LPLI抑制线粒体融合

5．3．3 HF—LPLI促进Drp1与线粒体稳定结合

5．3．4 过表达Drp1和Mfn2对线粒体动态变化的影响

5．3．5 Drp1和Mfn2在HF—LPLI诱导线粒体机能失调中的作用

5．4 讨论

展望

结束语

参考文献

缩略词

发表论文

致谢