斜纹夜蛾中肠胰凝乳蛋白酶基因(Slctlp1)的克隆、表达、定位及功能初步分析

摘要

丝氨酸蛋白酶广泛存在于鳞翅目昆虫中，在昆虫发育过程中参与了各种生理活动，包括食物消化、营养吸收，血液凝固，免疫反应，信号转导等。我们从斜纹夜蛾（Spodoptera litura）六龄第三天幼虫的中肠EST文库中获得一个编码胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）的全长cDNA，命名为Slctlpl（chymotrypsin like protein），克隆并分析了它的基因结构，组织定位，研究了它的发育和诱导表达，并进行了功能的初步鉴定。Slctlpl的cDNA由1009个核苷酸组成，编码295个氨基酸的多肽，预测的分子量为3 0.6 kDa，等电点为8.2 8。该基因编码的蛋白质具有昆虫胰凝乳蛋白酶典型的结构特征，包括催化三联体，与底物特异性结合的口袋和6个保守的半胱氨酸残基。和其他物种的核苷酸序列比对分析发现，该基因和草地贪夜蛾的同源性最高，相似性可达92％。Southern blot的结果表明，在斜纹夜蛾基因组中，该基因具有多个拷贝数。分别以cDNA和基因组DNA为模板，使用相同引物扩增出目的基因，并对PCR产物测序的结果分析，发现该基因有5个外显子和4个内含子。RT-PCR、Northern blot和Western blot检测发现，该基因无论是在转录水平还是在蛋白质水平主要都在幼虫的中肠表达，并且表达量在进食期较高，而在蜕皮、预蛹和蛹期的表达量明显减少。另外，SLCTLP1蛋白在表皮和脂肪体也有较低量的表达。分析SLCTLP1蛋白的分泌形式，发现该基因在中肠细胞合成后分泌到肠腔，并在肠腔被水解成有活性的蛋白。饥饿处理6龄幼虫后，该基因的mRNA和蛋白质水平明显降低，而重新进食又能刺激其表达的上升。这些结果暗示着Slctlp1基因与幼虫发育的进食期密切相关，推测可能参与了食物消化的过程。为了进一步了解它在昆虫生长发育中可能的作用，通过RNAi技术干扰该基因的表达，发现其mRNA和蛋白质水平的表达均有明显的抑制，但并没有观察到明显的表型变化。推测可能的原因是昆虫的中肠有许多类型的消化酶，这些消化酶可以起到补偿缺失Slctlp1基因的作用。

目录

文摘

英文文摘

主要符号对照表

第一章 引言

1.1 斜纹夜蛾

1.2 昆虫消化道

1.3 丝氨酸蛋白酶

1.4 胰凝乳蛋白酶

1.4.1 胰凝乳蛋白酶结构

1.4.2 胰凝乳蛋白酶的催化机制

1.4.3 胰凝乳蛋白酶的研究进展

1.5 RNAi技术

1.5.1 RNAi现象的发现

1.5.2 RNAi的作用机制

1.5.3 RNAi的应用

1.6 本课题的内容和实际应用意义

第二章 实验材料与实验方法

2.1 实验材料

2.1.1 昆虫培养

2.1.2 菌种、质粒

2.1.3 试剂和试剂盒

2.1.4 主要溶液及其配制

2.1.5 本实验用到的引物

2.1.6 主要仪器及设备

2.2 实验方法

2.2.1 Slcttp1基因的生物信息学分析

2.2.2 质粒提取

2.2.3 切胶回收

2.2.4 感受态细胞的制备

2.2.5 转化反应

2.2.6 PCR检测阳性克隆

2.2.7 pPROEX HTa-Slctlp1载体的构建

2.2.8 融合蛋白的诱导表达

2.2.9 蛋白纯化

2.2.10 抗SLCTLP1多克隆抗体的制备

2.2.11 昆虫总RNA的提取

2.2.12 Northern blot分析

2.2.13 蛋白的提取和SDS-PAGE蛋白电泳

2.2.14 Western blot分析

2.2.15 荧光免疫组化

2.2.16 Southern blot分析

2.2.17 cDNA的合成

2.2.18 dsRNA的合成

第三章 实验结果与分析

3.1 目的基因的获得及序列比对分析

3.1.1 目的基因的获得

3.1.2 Slctlp1序列的分析

3.1.3 GenBank中的Slctlp1序列

3.1.4 斜纹夜蛾胰凝乳蛋白酶基因序列的比较

3.1.5 SLCTLP1与其他物种的胰凝乳蛋白酶序列比对分析

3.1.6 SLCTLP1三维结构的预测

3.2 Slctlp1基因的结构和拷贝数的分析

3.2.1 Slctlp1基因的结构

3.2.2 Slctlp1在基因组中的拷贝数

3.3 原核系统表达SLCTLP1重组蛋白及其纯化

3.3.1 原核系统表达目的蛋白

3.3.2 目的蛋白的纯化

3.4 Slctlp1基因的表达模式

3.4.1 Slctlp1基因mRNA水平的时空表达

3.4.2 Slctlp1基因蛋白质水平的时空表达

3.5 SLCTLP1蛋白的组织定位

3.6 SLCTLP1蛋白的分泌情况

3.7 SLCTLP1蛋白的饥饿诱导表达

3.8 RNAi实验干扰Slctlp1基因的表达

3.8.1 dsRNA的合成

3.8.2 检测Slctlp1 dsRNA注射的效果

3.8.3 RNAi实验后昆虫的表型变化

第四章 讨论与总结

参考文献

附录A

在读期间发表的论文、摘要及参加的会议

致谢