花生防御素基因AhDRRP抗黄曲霉功能分析

摘要

黄曲霉毒素（AFT）是迄今毒性最强的一类生物毒素，具有致畸、致癌和致诱变作用，对人和动物具有强烈的毒性，其中黄曲霉毒素B1更被称为第一大类致癌物，严重威胁着人类的生命健康。花生是最容易感染黄曲霉毒素污染的作物之一。花生黄曲霉毒素污染已成为全球花生产业发展的主要限制因子。近年来，各国加大对花生黄曲霉毒素预防和控制力度，并实施严格的安全限量标准。解决花生黄曲霉毒素有许多途径，目前国内外认为培育抗性品种是解决花生免受黄曲霉毒素污染的最有效和最经济途经。
　　 本论文在前期抗黄曲霉相关基因筛选的基础之上，采用基因克隆、原核表达、亚细胞定位、实时定量PCR、以及遗传转化等技术，分析花生防御素基因抗黄曲霉侵染和产毒功能。
　　 实验结果表明：
　　 1、采用RACE方法克隆花生防御素基因全长cDNA序列，并命名为AhDRRP。经序列分析，该基因序列全长558bp，含一个225bp的开放阅读框。该基因编码一个由75个氨基酸组成的蛋白，其中蛋白的分子量为8.3 kDa，pI 5.03。预测分析表明花生防御素蛋白N端含有一个信号肽，含有保守的8个半胱氨酸及防御素基因共有的Gamma-thionin结构域。克隆得到的花生防御素基因组序列为225bp，测序表明其cDNA全长与基因组全长序列一致。
　　 2、构建pET32a-AhDRRP原核表达载体，经诱导获得原核表达AhDRRP融合蛋白。通过镍柱亲和层析后，获得纯化的28KD的AhDRRP蛋白。体外抑制黄曲霉试验表明：纯化的AhDRRP蛋白在体外能抑制黄曲霉生长的效果。
　　 3、构建了AhDRRP-GFP载体，并对其亚细胞定位进行分析，结果表明，AhDRRP主要定位在细胞壁。
　　 4、采用实时荧光定量PCR技术研究抗黄曲霉花生品种（粤油20）和易感黄曲霉品花生品种（粤油7）在正常生长、干旱处理、干旱处理同时人工接种黄曲霉三个处理情况下AhDRRP变化。结果显示：在干旱和黄曲霉菌人工接种处理下，抗性品种中AhDRRP基因表达显明显上调，其上调量是感病品种的8倍，表明该基因的上调表达与品种的抗性相关。
　　 5、构建pCAMBIA1301-AhDRRP花生超表达载体，通过农杆菌介导方法转化，获得经PCR验证的AhDRRP超表达花生植株4株，采用室内人工接种和ELISA KIT方法检测对超表达转基因植株进行检测，结果显示AhDRRP超表达植株的种子抗黄曲霉侵染能力显著高于转空载体的种子和未转基因种子，但黄曲霉毒素含量与转空载体和未转基因的种子毒素含量差异不显著，表明AhDRRP基因具有抗黄曲霉菌侵染而不具有抗黄曲霉菌产毒功能。
　　 6、通过Genomic-walking技术克隆AhDRRP上游启动子序列，经测序获得403bp上游序列，生物信息学分析预测其含有TATA box，CAAT box，此外还有防卫相关元件MYB1LEPR，响应病程诱导相关元件DOF以及植物激素调节元件ARR1-binding。

目录

文摘

英文文摘

主要符号对照表

第1章 引言

1．1 花生抗黄曲霉研究进展

1．2 植物防御素研究进展

1．2．1 防御素概述

1．2．2 植物防御素的结构和分类

1．2．3 植物防御素的表达调控

1．2．4 目前关于植物防御素抗菌假说

1．3 本研究的目的和意义

第2章 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌种

2．1．3 载体

2．1．4 酶类及其它试剂

2．1．5 常用溶液及培养基

2．1．6 主要仪器及设备

2．2 实验材料处理

2．3 RNA的提取及cDNA合成

2．4．AhDRRP基因组的扩增及上游序列的克隆

2．4．1 花生基因组DNA的提取

2．4．2 AhDRRP基因组的扩增

2．4．3 上游序列的获取

2．5 生物信息学分析所用的软件及网站

2．6 相对定量荧光PCR检测方法

2．6．1 第一链cDNA的合成

2．6．2 内参及引物设计

2．6．3 标准曲线定量法

2．6．4 荧光PCR反应体系及反就程序

2．7 载体的构建

2．7．1 原核表达载体的构建

2．7．2 亚细胞定位载体的构建

2．7．3 AhDRRP超表达载体的构建

2．8 原核表达及融合蛋白纯化

2．9 AhDRRP融合蛋白的抗黄曲霉活性分析

2．10 农杆菌介导的洋葱表皮细胞转化方法

2．11 AhDRRP超表达植株的获取及黄曲霉抗性检测

2．11．1 农杆菌介导AhDRRP遗传转化

2．11．2 拟超表达转基因花生植株PCR检测

2．11．3 超表达转基因花生植株种子的抗黄曲霉菌侵染检测

2．11．4 超表达转基因花生植株种子黄曲霉毒素B1的检测

第3章 结果与分析

3．1 AhDRRP 5’RACE ORF克隆及基因组扩增

3．2 AhDRRP基因序列基本信息分析

3．2．1 氨基酸序列同源性分析、多序列比对及系统发生树的构建

3．2．2 功能区域的预测

3．3 重组pET32a—AhDRRP蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化

3．3．1 原核表达载体pET32a—AhDRRP的构建

3．3．2 重组质粒pET32a—AhDRRP在大肠杆菌中的表达和纯化

3．4 AhDRRP原核表达蛋白的体外抑制黄曲霉检测

3．5 AhDRRP亚细胞定位分析

3．5．1 AhDRRP信号肽的预测

3．5．2 AhDRRP亚细胞定位载体构建

3．5．3 AhDRRP在洋葱表皮细胞中的定位

3．6 AhDRRP基因诱导表达谱

3．7 农杆菌介导AhDRRP的的花生遗传转化

3．7．1 pCAMBIA1301—AhDRRP超表达载体的构建

3．7．2 花生的遗传转化

3．7．2 花生遗传转化流程

3．7．3 超表达拟转基因花生PCR检测

3．7．4 AhDRRP超表达拟转基因种子抗黄曲霉侵染及产毒检测

3．8 AhDRRP启动子的克隆及序列分析

3．8．1 花生基因组DNA的酶切

3．8．2 特异性引物扩增启动子序列

3．8．3 启动子序列分析

第4章 讨论

4．1 花生防御素及其他物种防御素的结构和功能

4．2 花生防御素原核表达蛋白具有抗菌功能

4．3 花生防御素基因定位及其抗菌关系

4．4 拟超表达花生植株抑制黄曲霉菌的生长

4．5 AhDRRP的启动子结构元件

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文和研究成果