H7N9亚型流感病毒的遗传进化分析及对鸡的致病性研究

摘要

H7N9亚型流感感染病例于2013年2月19日在中国首次出现，至今为止人感染H7N9亚型流感病毒出现了三波疫情，不仅给人们健康带来威胁，也为我国养禽业造成了的巨大经济损失（WHO,2015），因此对H7N9亚型流感病毒的遗传进化关系及致病性进行研究具有重要的现实意义。
　　为了解家禽H7N9亚型流感病毒的流行情况，本研究于2013年至2015年采集了8770个家禽拭子和环境样品，共分离鉴定出28株H7N9亚型流感病毒，总分离率为0.32％。其中鸭源2株，环境2株，鸡源24株；来自江苏省的毒株2株，广西的毒株1株，其它26株均分离自广东。活禽交易市场24株，养殖场4株。
　　为研究H7N9亚型流感病毒的遗传进化关系，本研究以禽源的28株病毒和人源的1株病毒作为研究对象，分析了毒株的遗传演化规律。研究发现，第三波疫情中的14株H7N9亚型流感病毒的HA和NA基因均由第二波疫情中的病毒进化而来，且形成了两个进化分支，划分为W3-a和 W3-b分支，W3-a中的毒株主要分离自广东东莞、广州和惠州，该分支中的毒株和广东、香港和广西人源毒株位于同一进化分支，具有较近的亲缘关系，推测由第二波疫情中的本地毒株进化而来。W3-b中的毒株主要分离自潮州和汕尾，该分支中的毒株与新疆、福建、贵州、江苏人源或环境中的毒株在相同分支，具有较近的亲缘关系，推测本分支的毒株完成了通过野鸟或人员流动或家禽跨省调运的传播过程。第三波疫情中14株病毒的内部基因分析结果表明，H7N9亚型流感病毒的内部基因发生着进化和重组，个别毒株发生了多元重组。对29株H7N9病毒基因主要氨基酸位点的分析结果表明，人源毒株GH074/2013在PB2基因编码蛋白的第627个氨基酸位点为K，禽源毒株G1/2013在HA基因编码蛋白的第227个氨基酸位点为Q，其它毒株均具有氨基酸位点PB2-627E、PB2-701D、HA-226L(H3 numbering)、NA-289R(N9 numbering)、M2-31N和HA裂解位点PEIPKGRG。三波疫情中H7N9亚型流感病毒的主要氨基酸位点并无显著差异。
　　为了了解H7N9病毒对鸡的致病性情况，本研究选取了4株H7N9病毒做对SPF鸡的致病性实验。研究结果表明，4株H7N9病毒对鸡的致病力都很弱，感染4周龄SPF鸡后，所有鸡均未呈现明显的临床症状。仅在攻毒后第4d，G1组出现轻微采食量减少，其中有2只鸡精神沉郁，但第6d又恢复正常。H7N9亚型流感病毒可以通过同居方式感染其他健康鸡。选取的4株H7N9亚型流感病毒表现出不同的组织嗜性和在鸡体内的复制能力，G1毒株的组织嗜性和在鸡体内的复制能力稍强，所有毒株在肺脏组织的复制能力强。病理切片结果表明，4株H7N9亚型流感病毒对鸡的致病力弱，内脏组织仅出现轻微病变，病变产生的严重程度依次为肺脏＞肾脏＞盲肠扁桃体＞肝脏＞脾脏。

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1 前言

1.1 禽流感的病原学特性

1.2 H7N9亚型流感病毒的研究现状

1.3 研究目的及意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 供检样品

2.1.2 标准阳性血清

2.1.3 鸡胚

2.1.4 毒株

2.1.5 实验动物

2.1.6 常用试剂及配置

2.1.7 主要仪器

2.1.8 主要分子生物学试剂

2.1.9 主要生物学软件

2.2 方法

2.2.1 样品的采集

2.2.2 病毒分离

2.2.3 病原学鉴定

2.2.4 病毒的纯化

2.2.5 分子生物学鉴定及序列测定

2.2.6 H7N9亚型流感病毒对鸡的致病性试验

3 结果与分析

3.1 病毒的鉴定结果

3.2 分离毒株的分布特点

3.3 H7N9亚型流感病毒基因序列测定及遗传演化分析

3.3.1 HA基因序列及遗传演化分析

3.3.2 NA基因序列及遗传演化分析

3.3.3 内部基因的遗传演化分析

3.3.4 主要氨基酸位点突变分析

3.4 H7N9亚型流感病毒对鸡的致病性试验

3.4.1 4株病毒EID50的测定结果

3.4.2 感染SPF鸡临床表现

3.4.3 感染后SPF鸡肛咽和体内脏器的排毒情况

3.4.4 病理组织学变化

3.4.5 攻毒后第14d的血清抗体

4 讨论与结论

4.1 讨论

4.1.1 H7N9亚型流感病毒的流行病学调查

4.1.2 H7N9亚型流感病毒全基因序列测定及遗传进化分析

4.1.3 H7N9亚型流感病毒对鸡的致病性

4.2 结论

致谢

参考文献

附录A 攻读学位期间发表的与学位论文相关的学术论文

附录B 第三波疫情中14株H7N9亚型流感病毒部分基因的推导氨基酸序列