组蛋白去乙酰化酶参与ERF转录因子调控的香蕉果实成熟机制研究

摘要

香蕉是呼吸跃变型果实，成熟启动后果实迅速软化，给贮运保鲜带来很大困难。许多研究表明，ERF转录因子和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）在植物的生长发育过程中发挥着重要作用。我们前期的研究发现，与成熟密切相关的MaERFs不仅可以反馈调控乙烯合成基因MaACS1和MaACO1，而且可以与MaACO1蛋白相互作用，从而参与香蕉果实成熟过程的转录调控。然而，HDAC是否参与以及怎样参与ERF调控香蕉果实成熟机制目前并不清楚。本文在明确MaERF11参与香蕉果实成熟的基础上，通过通过凝胶组织迁移实验（EMSA）、双荧光素酶报告基因实验（DLR）、蛋白互作技术和染色质免疫共沉淀（ChIP）等多种实验手段深入研究了HDAC参与ERF调控香蕉果实成熟机制，我们的研究结果拓宽了果实成熟的转录调控网络，尤其是在组蛋白去乙酰化修饰参与调控果实成熟机制方面加深了人们对果实成熟及其调控机制的认识。本文获得的主要研究结果和结论如下：
　　1.MaERF11具转录抑制活性，它可以结合乙烯合成基因MaACO1和3个果实软化相关基因MaEXP2/7/8的启动子，进而参与调控香蕉果实的成熟过程。EMSA和ChIP实验表明，MaERF11可以结合乙烯合成基因MaACO1和3个果实软化相关基因MaEXP2/7/8的启动子。另外，DLR检测结果显示，MaERF11具有转录抑制活性，能抑制下游基因MaACO1和MaEXP2/7/8的启动子活性。这些结果说明，MaERF11作为转录抑制子，可以通过对乙烯合成基因MaACO1和果实软化相关基因MaEXP2/7/8的抑制作用来调控乙烯的合成和果实的软化。
　　2.成熟相关基因MaACO1和MaEXP2/7/8的表达及其组蛋白乙酰化水平变化与果实成熟密切相关。荧光定量PCR（qRT-PCR）结果显示，MaACO1和MaEXP2/7/8基因的表达在采后香蕉后熟进程中均呈现不同程度的上升趋势。ChIP结果显示，成熟香蕉果实的MaACO1和MaEXP2/7/8基因染色质上的组蛋白H3和H4的乙酰化水平会高于未成熟的香蕉，这与基因的表达趋势相吻合。这些结果说明，MaACO1和MaEXP2/7/8的表达及其染色质上组蛋白的乙酰化水平与香蕉果实成熟密切相关。
　　3.MaERF11通过招募MaHDA1形成转录抑制复合体,共同调控MaACO1和MaEXP2/7/8的转录表达。酵母双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）和免疫共沉淀（Co-IP）的结果均说明MaERF11与 MaHDA1之间存在相互作用关系，并且，MaHDA1具有HDAC保守域和组蛋白去乙酰化酶活性，可以增强MaERF11对下游靶基因MaACO1和MaEXP2/7/8的抑制作用。这些结果共同说明，MaERF11与MaHDA1可以形成转录抑制复合体，共同调控后熟相关基因MaACO1和MaEXP2/7/8的表达，从而参与调控香蕉果实的后熟衰老过程。
　　4.从香蕉基因组序列中获得了17个MaHDACs基因，可以分为RPD3/HDA1、HD2和SIR2三个不同亚族，并且它们在香蕉果实后熟过程中呈现不同的表达模式。我们从香蕉基因组中鉴别出17个MaHDACs基因，通过进化树关系和氨基酸序列保守域分析发现，其中的MaHDA1-12编码的氨基酸序列都包含一个HDAC保守结构域，属于RPD3/HDA1亚家族；MaHDT1-3编码的氨基酸序列在N端都有一个MEFWG保守域,属于HD2亚家族；而MaSRT1/2编码的氨基酸序列都有一个SIR2保守域，属于SIR2亚家族。qRT-PCR分析结果显示，17个MaHDACs在香蕉果实后熟进程中呈现出不同的表达模式，其中，尤以MaHDA6的表达变化最明显，在三个不同处理的香蕉果实中均表现出明显的上调趋势。
　　5.探讨了MaHDA6在乙烯信号转导和果实成熟中的调控机制。研究表明，MaHDA6定位于细胞核内，具有组蛋白去乙酰化酶活性，ChIP结果显示，MaHDA6可以结合MaERF11/15的启动子，并且成熟香蕉果实的MaERF11/15基因染色质上组蛋白乙酰化的水平低于未成熟的香蕉，这与它们的表达是一致的。这些结果说明，MaHDA6可能通过去乙酰化作用来调控下游基因MaERF11/15的表达，从而参与调控乙烯信号转导途径和香蕉果实的后熟衰老。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

缩 略 词 表

目录

第一章 综 述

1.1 香蕉概述

1.2香蕉果实成熟机制研究进展

1.3 ERF（Ethylene response factor）转录因子的研究进展

1.4组蛋白去乙酰化酶的研究进展

1.5本研究的目标和意义

第二章MaERF11通过抑制MaACO1和MaEXP2/7/8的表达来参与调控香蕉果实的后熟

2.1 引言

2.2材料与方法

2.3结果与分析

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 MaERF11招募MaHDA1调控香蕉果实后熟过程中MaACO1和MaEXP2/7/8的表达

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

3.5 小结

第四章MaHDACs的转录表达分析以及MaHDA6对MaERF11/15的调控作用

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3结果与分析

4.4 讨论

4.5 小结

结论与推论

致谢

参考文献

附录A在读期间发表的论文

附录B引物列表