结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)腺苷酸琥珀酸裂解酶功能及其催化活性位点的研究

摘要

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是慢性传染病结核病的致病菌，可侵及许多脏器，以肺部结核感染最为常见，全球每年死于结核病的人数多达150万，而随着结核分枝杆菌全基因组测序的完成与寻找新抗结核药物靶位的迫切需求，阐明结核分枝杆菌的基因功能，特别是潜在的药物靶标的结构和功能具有重要的意义。
　　嘌呤合成代谢途径是结核分枝杆菌细胞内重要的生物合成途径，也是研发新的抗结核药物的潜在靶点，对于嘌呤合成代谢基因的研究不仅有利于加深人们对结核分枝杆菌的了解，也可为研发新的抗结核药物提供理论指导。
　　本实验克隆了结核分枝杆菌嘌呤合成代谢途径中的腺苷酸琥珀酸裂解酶基因purB，并通过分子改造获得了MtpurB点突变Arg10Glu、His76Glu、Thr104Lys、His147Ala、Gln229Ala、Ser277Ala、Ser278Ala、Lys283Glu、Arg291Glu、Arg326Glu、His76Glu/ Lys283Glu（2 mut）、Arg10Glu/ Arg291Glu/ Arg326Glu（3 mut）的基因。随后，构建体内互补用的pBAD24系列载体。将pBAD24系列质粒载体转化至大肠杆菌（Escherichia coli）purB基因插入失活突变株SE1888中，观察互补菌株在 MG基础培养基上的生长情况。实验结果显示 MtpurB基因与点突变MtpurB Ser278Ala基因在添加与不添加诱导剂的MG基础培养基上均能生长，初步确定了 MtpurB所编码的蛋白具有腺苷酸琥珀酸裂解酶的功能，并且确定了MtPurB蛋白的Arg10、His76、Thr104、His147、Gln229、Ser277、Lys283、Arg291以及Arg326是腺苷酸琥珀酸裂解酶的活性位点。
　　为了进一步了解MtPurB蛋白的功能，本实验通过等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry，ITC)测定了MtPurB以及其点突变蛋白MtPurB R10E、MtPurB S278A和MtPurB K283E的酶促反应动力学参数。发现MtPurB在37℃、pH7.0的反应条件下酶活性和底物亲和能力最高。该条件下，MtPurB对于底物SAMP的Kcat为1.62±0.0092 S-1，Km为0.104±0.0031 mM，而对于底物SAICAR的Kcat为0.784±0.0085 S-1，Km为0.0233±0.0013 mM。而MtPurB点突变蛋白Arg10Glu、Ser278Ala的催化效率较之野生型蛋白明显降低。其中 MtPurB Ser278Ala对于两种底物的催化效率均降低了约2倍，MtPurB Arg10Glu对于底物SAMP的催化效率约降低了8倍，而MtPurB Arg10Glu对于底物SAICAR的催化效率降低了40余倍。另外，MtPurB点突变蛋白Lys283Glu在体外反应中则完全测定不到催化活性，这一点也与之前互补菌株的生长情况相符合。

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1 前言

1.1 结核分枝杆菌简介

1.2 嘌呤核苷酸简介

1.3 嘌呤核苷酸合成代谢

1.4 结核分枝杆菌嘌呤核苷酸合成代谢的研究

1.5细菌腺苷酸琥珀酸裂解酶研究简介

1.6本研究的意义和目的

1.7本研究技术路线

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 试剂和试剂盒

2.3 仪器

2.4 主要试剂配方

2.5 实验方法

3 结果与分析

3.1 生物信息学分析

3.2 载体的构建

3.3遗传互补表型分析

3.5蛋白的表达和纯化

3.6蛋白的酶促反应动力学研究

4 结论与讨论

4.1 讨论

4.2 结论

致谢

参考文献