融合必需氨基酸多肽在鱼腥藻PCC 7120中的表达及其条件优化

摘要

鱼腥藻PCC7120（Anabaenasp. PCC7120）属于真细菌类中的一种进行产氧性光合自养，能固氮的革兰氏阴性多细胞丝状原核生物；其结构简单，优点诸多如培养简单，生长周期短，易于基因工程改良等已成为分子生物学和基因工程研究中的重要模式生物和稳定的基因表达宿主。同时鱼腥藻PCC7120富含蛋白质、核酸、脂类等多种营养要素，可作为动物饲料蛋白资源的开发和利用。本研究基于鱼腥藻PCC7120遗传学研究进展和动物饲料添加剂是氨基酸重要终端市场，利用鱼腥藻PCC7120偏爱密码子设计了能特异性表达多种必需氨基酸组成小肽的外源目的HEP234基因片段并对其进行改良引入融合序列，通过基因工程手段体外构建含上述目的基因片段的融合序列，强启动子的穿梭质粒pHEP130并经过三亲结合转移转化鱼腥藻PCC7120，筛选纯化获得质粒稳定性阳性转基因藻株，对转基因鱼腥藻PCC7120进行分子水平的检测和蛋白水平的诱导表达，印迹杂交鉴定，证实外源目的基因在转基因藻株的存在。此外，逐一优化了转基因鱼腥藻PCC7120生长条件，确定了优化条件培养下的转基因藻的外源目的基因表达效率有明显提高。其中本研究主要结果如下：
　　（1）根据鱼腥藻PCC7120偏爱密码子设计了能特异性表达13种动物必需氨基酸组成小肽的外源目的HEP234基因片段，该基因片段总长78 bp；在此基础上改良了HEP234使其N端引入TEV蛋白酶识别序列和GFP序列，C端引入His-tag标签；含外源目的基因片段的融合序列总长为819 bp。实验过程初成功构建了含上述外源目的基因的融合序列，强启动子Lac C的穿梭表达质粒pHEP130，并通过三亲结合转移转化鱼腥藻PCC7120，经3次纯化筛选获得阳性转化转基因藻株。
　　（2）基因工程菌质粒稳定性是其高效表达目的基因产物的理论基础。实验过程中分别采用平板稀释法和平板计数法综合比对了有无选择压力培养下连续传代 E.coli NEB10β::pHEP130和PCC7120::pHEP130的生长情况，并随机挑取5代单克隆质粒PCR鉴定，结果证实E.coliNEB10β::pHEP130在147代质粒未发生缺失，PCC7120::pHEP130在连续传代10次仍能保持质粒稳定性。
　　（3）在实验室常规培养条件（恒温30℃，连续光照70μE m-2s-1，110 rpm振荡）下得到了转基因鱼腥藻PCC7120有无氮源培养条件下的生长曲线，并确立了5~17d内加氮条件下的转基因藻生长速率明显高于缺氮培养。故在后续实验中，选取加氮条件下培养15d的转基因鱼腥藻PCC7120进行目的基因融合蛋白的提取。
　　（4）纯化后的阳性转基因高效表达藻株通过诱导表达，破碎提取，Ni柱纯化，亲和层析等技术手段可获得目的基因融合蛋白，其最佳获取条件为1mmol/L诱导物IPTG诱导，超声破碎破壁处理提取。最后通过TEV蛋白酶酶切鉴定可初步获得目的小肽HEP234 Protein。
　　（5）采用单因素控制变量法逐一探究种子液、温度、pH、光照、外源碳源、氮源对转基因鱼腥藻PCC7120生物量和目的基因融合蛋白表达效率的影响，并得出可能的最佳组合培养条件为：转种生长对数期的种子液于 AA/8N液体培养基，接种量6％，28℃，1500 Lux连续光强，110 rpm恒速振荡，添加外源碳源（碳含量50 mmol/L）如葡萄糖，蔗糖。优化培养条件较常规培养可明显提高目的基因融合蛋白的表达量，上述添加葡萄糖优化条件下的培养最终转基因藻生物量较常规培养增加43.8%。这为大规模实际生产提供参考意义。

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1前言

1.1 蓝藻概述

1.2 蓝藻遗传学研究进展

1.3 鱼腥藻PCC 7120的生物学特性

1.4 绿色荧光蛋白及其在分子生物学研究中的应用

1.5 多肽动物饲料添加剂及其在鱼腥藻PCC 7120中的应用

1.6 本研究的目的意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 实验方法

3 结果与分析

3.1 表达质粒的构建及检验

3.2 大肠杆菌表达质粒pHEP130质粒稳定性验证

3.3 转基因鱼腥藻PCC 7120阳性克隆筛选纯化

3.4 转基因鱼腥藻PCC 7120表达质粒稳定性研究

3.5转基因鱼腥藻PCC 7120生长曲线

3.6 转基因鱼腥藻PCC 7120不同破壁方法蛋白提取比较

3.7 转基因鱼腥藻PCC 7120融合蛋白电泳分离

3.8 转基因鱼腥藻PCC 7120融合蛋白诱导表达

3.9 转基因鱼腥藻PCC 7120融合蛋白Ni柱纯化

3.9 转基因鱼腥藻PCC 7120融合蛋白免疫印迹

3.10 转基因鱼腥藻PCC7120融合蛋白TEV酶切鉴定

3.11 转基因鱼腥藻PCC 7120生长条件初步优化

4 讨论与结论

4.1 讨论

4.2 结论

致谢

参考文献