水稻干尖线虫和菊花叶枯线虫的LAMP检测方法研究

摘要

水稻干尖线虫（Aphelenchoides besseyiChristie，1942）和菊花叶枯线虫（Aphelenchoides ritzemabosi(Schwartz，1911)Steiner&Buhrer，1932）同为滑刃属（Aphelenchoides Fischer，1984）的重要植物病原线虫，能分别危害多种作物，是一些国家或地区的植物检疫性有害生物。滑刃属线虫形态相似，传统形态学方法鉴定困难、操作复杂、耗时耗力，对检测鉴定人员的专业水平要求程度高，在检疫和监测工作中迫切需要具备这两种线虫的分子检测鉴定技术。环介导等温扩增（LAMP）具有快速、检测结果肉眼可见、不需要特殊仪器的特点。本研究基于水稻干尖线虫和菊花叶枯线虫的18S核糖体RNA基因分别设计对这2种线虫进行LAMP的特异引物，并利用这2个LAMP引物研究建立具有特异性强、稳定性好、灵敏度高和可操作性强的水稻干尖线虫和菊花叶枯线虫LAMP检测方法，研究结果如下。
　　获得了水稻干尖线虫LAMP引物 B77t和菊花叶枯线虫LAMP引物R81t，B77t包括了一对外引物、一对内引物和一对环引物共六条引物，R81t包括了一对外引物、一对内引物和一条环引物共五条引物；建立了基于引物B77t和引物R81t并采用钙黄绿素染料检测LAMP反应结果的水稻干尖线虫LAMP和菊花叶枯线虫LAMP检测方法。利用这2种线虫的LAMP检测方法能分别从不同目、不同科、不同属以及同属不同种类的线虫中特异的检测出水稻干尖线虫和菊花叶枯线虫，能稳定的检测鉴定同种线虫的不同种群以及不同发育虫态的个体，对水稻干尖线虫和菊花叶枯线虫的检测灵敏度分别达到1/1000和1/100单条虫DNA；另外，这2个LAMP检测方法，还成功从种类混合的线虫样品中和植物组织样品中直接检测目的线虫，可以省略分离线虫的步骤，达到简便、准确和快速鉴定的目的。
　　本研究为水稻干尖线虫和菊花叶枯线虫的快速鉴定和早期诊断提供了一个新的检测方法，其具有准确、灵敏、稳定、反应结果肉眼可见和实用性强的优势。为口岸检疫、调运检疫和产地监测中的水稻干尖线虫和菊花叶枯线虫的快速检测鉴定提供了有效的手段，对阻止这2种植物病原线虫的传播扩散具有重要意义。

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1前言

1.1 水稻干尖线虫生物学特性和发生概况

1.2 菊花叶枯线虫生物学特性和发生概况

1.3 形态学检测方法

1.3 分子检测方法

1.4 环介导恒温扩增技术

1.5 研究内容与意义

2 材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

3 结果与分析

3.1 引物筛选结果

3.2 LAMP引物特异性和稳定性检测

3.3 LAMP检测方法灵敏度

3.4 混合样品DNA检测

4 结论与讨论

4.1水稻干尖线虫和菊花叶枯线虫的LAMP方法检测

4.2 LAMP引物的设计与片段的选取

4.3 LAMP结果的检测方法对比

4.4 多种线虫混合样品和植物组织中的目标线虫检测

4.5 LAMP检测方法检测两种滑刃线虫与PCR方法对比

4.6研究的创新性和意义以及有待进一步研究的问题

致谢

参考文献

附录