基于SRAP分子标记的四药门花种群遗传多样性分析

摘要

四药门花Loropetalum subcordatum(Benth.) Oliv.属金缕梅科（Hamamelidaceae）常绿小乔木或灌木，单叶互生，叶片卵形或椭圆形，嫩叶红色，老叶深绿色；花白色，花瓣5枚。四药门花是中国特有极小种群植物，被列为国家二级保护植物，同时也被列入国际联合自然保护（IUCN）名录中。四药门花对于研究生态多样性、物种多样性、遗传多样性和植物进化演替有着重要意义和作用。目前，由于人类的频繁活动导致其原生境遭到了破坏和退化，甚至是消亡。因此，四药门花的保护迫在眉睫。了解濒危植物的遗传结构和遗传多样性是成功保护这些植物的基础与前提。本研究利用SRAP分子标记技术对6个四药门花野生种群和1个迁地种群遗传多样性进行研究和评价，通过对实验数据的分析和讨论提出相应的保护措施，为四药门花的迁地保护和回归引种建立理论基础和参考依据，也为四药门花的拯救和保护打下基础，本研究的主要结果如下：
　　1.四药门花SRAP-PCR反应体系建立
　　通过单因素试验获得了20μl四药门花 SRAP-PCR反应体系的模板 DNA用量、dNTPs浓度、Mg2+浓度、Ex Taq用量和引物浓度的最适范围，分别为：40~80ng、0.25~0.4mmol/L、2.00~3.50mmol/L、1.5~3.0U和0.2~0.35μmol/L。然后以单因素试验结果为基础，通过正交试验获得了20μl四药门花SRAP-PCR反应的最佳体系：模板DNA用量为60ng，Mg2+浓度为3.5mmol/L，dNTPs浓度为0.25mmol/L，Ex Taq酶用量2.5U，引物浓度是0.3μmol/L。
　　2.四药门花野生种群的遗传多样性
　　15对SRAP引物组合共扩增出553条条带，其中条多态性条带共359，多态性百分比达63.28％。在6个四药门花野生种群中，贵州荔波（GZ）的遗传多样性最高，PPF为21.7%；香港大屿山（DY）的遗传多样性最低，PPF仅有3.98%；广西环江（GX）、广东五桂山（WG）、香港宝云道（BY）和香港紫罗兰山径（ZL）的遗传多样性分别为17%、13.2%、7.78%和7.23%。四药门花野生种群的观测等位基因数目（Na）范围在1.0398~1.2170，有效等位基因数目（Ne）变化范围在1.0247~1.1620，Nei’s遗传多样性范围（H）在0.0145~0.0904，Shannon多样性指数（SI）在0.0217~0.1308，这些结果表明四药门花存在较低的遗传多样性。
　　3.四药门花野生种群的遗传结构
　　四药门花存在较高的遗传分化，种群之间的基因交流极低（Nm*=0.1342），同时群体间遗传分化系数（Gst）为0.7884，这说明有78.84%的遗传变异属于种群间的遗传变异。通过对四药门花野生种群进行非加权平均（UPGMA）聚类、主成分坐标分析（PcoA）和贝叶斯算法的计算结果都得出了相同的遗传结构，结果显示将四药门花6个野生种群分成了三个组，贵州荔波（GZ）和广西环江（HJ）的野生种群亲缘关系较近，为一组；广东五桂山（WG）独自一组；香港的三个野生种群（BY、ZL、DY）为一组。同时，Mantel检验结果显示四药门花种群间的遗传距离和地理距离具有明显相关性(r=0.91，p=0.01)，且线性方程为y=1740.3x-68.095，这说明了四药门花遗传距离与地理距离呈正相关。
　　4.四药门花迁地保护种群遗传多样性和遗传结构
　　中山市迁地保护种群（ZS）的遗传多样性为7.59%，远低于其种源地广东五桂山野生种群（WG）的13.2%。两个群体的遗传分化系数（Gst）是0.0889，这表明有8.89%的遗传变异发生在两个群体之间。四药门花中山迁地保护种群的观测等位基因数目和有效等位基因数目与其种源地广东五桂山野生种群的差异较小，差异都在5%以内；而中山迁地保护种群的多态性位点数、Nei’s遗传多样性和 Shannon多样性指数分别占广东五桂山野生种群的57.53%、62.42%和61.57%，远低于其种源地广东五桂山野生种群。这表明四药门花中山迁地保护种群并没有完全覆盖其种源地五桂山野生种群的遗传多样性构，且差异较大。通过POPGEN32软件计算，确定14株广东五桂山自然种群的植株的遗传多样性能够覆盖广东五桂山自然种群的遗传多样性。

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1 前言

1.1 四药门花

1.2 四药门花研究进展

1.3 遗传多样性研究

1.4 研究目的和意义

1.5 研究内容

2 材料与方法

2.1材料

2.2实验试剂及仪器

2.3 总DNA提取与检测

2.4 SRAP-PCR反应体系建立与优化

2.5 基因组DNA的遗传多样性检测

2.6 数据收集与统计分析

2.7试验时间

3 结果与分析

3.1 四药门花DNA的提取与检测

3.2 四药门花SRAP-PCR反应体系建立与优化

3.3 四药门花SRAP-PCR引物筛选

3.4 四药门花不同地理群体的遗传多样性分析

4讨论与结论

4.1结论

4.2讨论

致谢

参考文献