纳米银对念珠藻的毒性效应及其机理研究

摘要

纳米银（AgNPs）是目前国内外生产和使用量最大的纳米材料之一，由于AgNPs具有多种优越的性能，被广泛应用于工业生产、医疗卫生和环境保护等领域。AgNPs可能在产品生产、使用和回收等环节中通过多种途径进入到水体环境中，对水生生态系统中的非靶标生物造成潜在威胁。关于 AgNPs对一些微藻和微型水生动物的毒性已经有很多的报道，但是关于 AgNPs对具有重要生态功能的丝状固氮蓝藻影响的研究鲜有报道。同时，关于AgNPs对微型藻类的毒性效应机理存在争议。因此，本论文选用念珠藻（Nostoc sp.）为实验材料，研究用柠檬酸钠还原法制备的AgNPs和银离子（Ag+）对念珠藻的急性和亚急性毒性效应，试图从藻形态结构、生理、生化改变等角度揭示AgNPs对丝状固氮蓝藻-念珠藻的致毒机理。主要研究结果如下：
　　急性毒性实验（4d）中，在0~48h内，AgNPs和Ag+处理后，培养液中溶解态银浓度均逐渐下降并趋于平衡。AgNPs处理的小颗粒银浓度在0~6h内急剧下降，但在24h后趋于稳定。Ag+处理的小颗粒银浓度在0~12h内几乎没有变化，但到12h后显著升高到24h达到最高。显微观察发现高浓度的AgNPs和Ag+均可引起细胞收缩、质壁分离、胞内物质紊乱和细胞壁裂解等现象，AgNPs处理后疑似有银颗粒进入了细胞内部。所有浓度AgNPs和Ag+处理4d后的念珠藻干重、Chla含量、藻体TC含量、藻体碳/氮比和固氮酶活性均显著低于 CK，而藻体总氮含量（TN）均显著高于对照。AgNPs处理后，培养液中碳/氮比均显著高于CK，而0.04 mg·L-1 Ag+处理组碳氮比（C/N）低于CK，但0.06 mg·L-1 Ag+处理则与CK比无显著差异。Ag+处理4d后，藻叶绿素荧光参数值Fm、Fv/Fm、Ψ0、ΦE0和PIABS均显著低于CK，而ΦD0、ABS/RC、TR0/RC和DI0/RC均显著高于CK，特别是ABS/RC和DI0/RC增加了97％和126%。但0.6 mg·L-1 AgNPs处理仅F0、Fm和ΦD0显著降低，而Fv/Fm、Ψ0、ΦE0和PIABS显著升高。同时，0.4 mg·L-1 AgNPs处理所有参数均与CK无显著差异。说明短期作用后，Ag+和AgNPs均对藻产生胁迫作用，但AgNPs对藻光合系统II的影响比Ag+小。
　　亚急性毒性实验（9d）中，仅高浓度AgNPs和Ag+处理使念珠藻干重和Chla含量显著低于 CK。Ag+处理均使藻体 C/N显著降低，但 AgNPs处理无影响。0.6 mg·L-1 AgNPs处理使培养液中C/N、藻体可溶性蛋白和藻胆蛋白含量显著高于CK，其余处理组无显著变化。Ag+显著降低念珠藻固氮酶活性，AgNPs则对固氮酶活性无显著影响。处理9d后藻细胞蛋白二维电泳记录到超过200个差异蛋白点，选择与CK表达差异超过2.5倍以上的132个点进行了蛋白定性，只匹配到51蛋白质，扣除12个重复的蛋白，总共定性差异蛋白39个。当0.06 mg·L-1 Ag+处理后，藻细胞中26个蛋白显著上调，但6种蛋白的表达下调，而0.6 mg·L-1 AgNPs处理时，22个蛋白显著上调，3个显著下调。对两种形态银处理，上调蛋白中有相同蛋白10个，下调蛋白中有1个相同，但唯有一种在光合作用的卡尔文循环中起关键作用蛋白-转酮醇酶在AgNPs处理时显著上调，Ag+处理时显著下调。同时，Ag+处理抑制固氮酶表达，但AgNPs处理没有变化，这与前述乙炔还原法测定到固氮酶活性结果一致。AgNPs处理时别藻蓝蛋白上调，但Ag+处理未发现变化，这与光度法测得结果一致。另外，Ag+使微藻抗氧化的重要酶类－超氧化物歧化酶上调，但是AgNPs处理没有这种变化。Ag+处理9d后，藻叶绿素荧光参数值F0、Fm、Fv/Fm、Ψ0、ΦE0、PIABS和ET0/RC均显著高于对照，但ΦD0、VJ、ABS/RC、TR0/RC和DI0/RC值均显著低于CK，特别是ABS/RC和DI0/RC两个参数值分别降低超过70%。但对于AgNPs，仅0.4 mg·L-1和0.6 mg·L-1处理F0值和0.6 mg·L-1处理Fm值显著高于CK以外，其他参数均与CK无显著差异。这与急性实验的参数值变化趋势几乎完全相反。上述结果说明AgNPs和Ag+对念珠藻细胞光合作用、固氮作用、蛋白合成的影响存在明显差异。另外，实验结果表明随AgNPs和Ag+浓度的增加，藻体银含量增加，0.6 mg·L-1 AgNPs处理时藻到富集量最大，且同种处理方式下藻体银含量在第9d的含量均低于第4d。
　　结合上述生长和生理生化数据，说明念珠藻在短期受到高浓度AgNPs和Ag+的毒害比较严重，但从处理9d后的生理生化指标变化的结果来看，念珠藻对 Ag+和AgNPs均产生了相当程度的适应，但对两种形态银的适应策略存在明显差异。

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1 前言

1.1 纳米银的简介

1.2 AgNPs对微藻毒理效应研究现状

1.3 AgNPs对微藻毒理效应机理

1.4本文研究的目的和意义

1.5 本实验设计路线

2 实验材料和方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 数据分析

3 实验结果

3.1 AgNPs的表征特性

3.2 AgNPs和Ag+在念珠藻培养液中的变化

3.3 AgNPs对念珠藻的96h-EC50

3.4 AgNPs和Ag+对念珠藻形态和细胞结构的影响

3.5 AgNPs和Ag+对念珠藻生物量的影响

3.6 AgNPs和Ag+对念珠藻Chla合成的影响

3.7 AgNPs和Ag+对念珠藻培养液和藻体碳氮比（C/N）影响

3.8 AgNPs和Ag+对念珠藻叶绿素荧光的影响

3.9 AgNPs和Ag+对念珠藻可溶性总蛋白的影响

3.10 AgNPs和Ag+ 对念珠藻藻胆蛋白的影响

3.11 AgNPs和Ag+对念珠藻固氮酶活性的影响

3.12 AgNPs和Ag+对念珠藻差异蛋白表达的影响

3.12 银在藻体内的积累

4 讨论与结论

4.1 讨论

4.2 结论

5 研究不足与展望

致谢

参考文献