矮牵牛花香相关的ERF筛选及其调节机理初探

摘要

矮牵牛是一种模式植物，能被用来研究乙烯信号转导和花香合成途径。乙烯响应因子ERF在乙烯信号转导途径的最下游，含有AP2/ERF结构域，在果实成熟、花衰老、植物生长发育、逆境响应和激素调节等方面有重要的作用。前人的研究发现矮牵牛授粉后香气会急剧减少，而此时乙烯却急剧增加，表明矮牵牛花香受乙烯调节。ERF作为乙烯信号转导途径的组分，为了解矮牵牛ERF在调节花香合成中的作用机理，本研究在获得第Ⅷ族的ERF转录因子的基础上，分析了ERF转录因子对花香基因的调控关系，PhERF6的表达特性，VIGS沉默PhERF6和PhERF30后，花香转录因子和花香合成酶基因的表达，以及PhERF30的亚细胞定位情况，以期了解PhERF与花香合成的关系。研究结果如下：
　　1.利用双荧光素酶检测体系，分析了PhERF6、PhERF25和PhERF30转录因子对花香基因ODO1、EOBI、EOBII、PAAE、BPBT、PAL表达的影响。结果显示：PhERF6的超表达显著降低ODO1、BPBT和PAL的表达。另外，沉默PhERF30后，ODO1、EOBII和EOB1的表达显著上升，同样，沉默PhERF25后，EOBI的表达也显著上升。表明PhERF6、PhERF25和PhERF30都能抑制花香基因的表达来影响花香的生物合成。
　　2.利用酵母杂交系统研究蛋白之间的相互作用，筛选并获得了与矮牵牛 PhERF6转录因子互作的蛋白。PhERF6全长能与ODO1和EOBI的全长互作，EOBI互作的核心域位于N端，说明PhERF6可能通过与花香转录因子的互作来调控花香的合成。
　　3.实时荧光定量分析表明，PhERF6的表达呈现出昼夜节律性的表现，和矮牵牛花香释放的规律是协调的，表明PhERF6在矮牵牛花香释放的过程中呈现不同的表达特征，参与矮牵牛花香的生物合成。利用 VIGS沉默体系，减少花瓣中 PhERF6和PhERF30的表达量，花香转录因子以及花香合成酶基因的表达量均上升,说明了PhERF6和PhERF30对花香转录因子和花香合成酶基因的表达有抑制作用。
　　4.亚细胞定位分析表明，PhERF30定位在细胞核。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

英文缩略词与英汉对照

目录

1 前言

1.1 转录因子的结构特征及作用机制

1.1.1 转录因子的结构特征

1.1.2 转录因子的作用机制

1.2 ERF转录因子研究现状

1.3 矮牵牛花香的研究现状

1.3.1 矮牵牛花香生物合成特点

1.3.2 矮牵牛花香合成酶基因研究现状

1.3.3 矮牵牛花香转录因子的研究现状

1.3.4 矮牵牛花瓣中花香挥发物合成及其相关基因表达受乙烯调控

1.4 研究目的与意义

2 材料与方法

2.1 实验材料与用品

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌种与质粒

2.1.3 试剂配方

2.1.4 PCR引物

2.1.5 主要仪器和设备

2.2 实验方法

2.2.1 矮牵牛总RNA的提取

2.2.2 cDNA的合成

2.2.3 基因的克隆

2.2.4 载体的构建

2.2.5 重组载体导入农杆菌

2.2.6 双荧光素酶侵染体系

2.2.7 酵母诱饵载体构建与矮牵牛cDNA文库双杂交

2.2.8 材料处理与取样

2.2.9 实时荧光定量PCR

2.2.10 瞬时表达与亚细胞定位分析

2.2.11 数据统计分析及作图

3 结果与分析

3.1 双荧光素酶体系载体的构建

3.1.1 超表达载体的构建与鉴定

3.1.2 启动子表达载体的构建与鉴定

3.2 PhERF对花香基因的转录调节

3.2.1 PhERF对花香ODO1基因表达的转录调节

3.2.2 PhERF对花香EOBI基因表达的转录调节

3.2.3 PhERF对花香EOBII基因表达的转录调节

3.2.4 PhERF6对花香PAL、BPBT和PAAE基因表达的转录调节

3.3 酵母双杂交cDNA文库筛选PhERF6互作蛋白

3.3.1 重组质粒pGBKT7-PhERF6载体的构建

3.3.2重组载体转化酵母及自激活鉴定

3.3.3 pGBKT7-PhERF6诱饵载体与cDNA文库杂交及阳性克隆初步筛选

3.3.4 酵母双杂交分析蛋白互作

3.4 PhERF6在不同生长阶段的表达分析

3.4.1 PhERF6在花蕾不同阶段的表达分析

3.4.2 PhERF6在自然状态下节律性的表达分析

3.5 VIGS沉默PhERF6对花香转录因子和合成酶基因表达的影响

3.5.1 VIGS沉默PhERF6对花香转录因子表达的影响

3.5.2 VIGS沉默PhERF6对花香合成酶基因表达的影响

3.6 VIGS沉默PhERF30对花香转录因子和合成酶基因表达的影响

3.6.1 VIGS沉默PhERF30对花香转录因子表达的影响

3.6.2 VIGS沉默PhERF30对花香合成酶基因表达的影响

3.7 PhERF30的亚细胞定位

4 讨论

5 结论

致谢

参考文献

附录A

附录B