干湿交替诱导水稻根表红棕色铁膜形成的生理与分子机理

摘要

干湿交替是协调水稻根际水分与氧气供应的一种重要农艺措施。干湿交替在稻田中的应用，能够显著提高水稻的根系活力，有利于水稻高效、高产、优质的形成。根表铁膜是水稻适应逆境环境下形成的天然屏障，对促进营养元素的高效吸收和阻隔有害重金属元素向稻米籽粒运输发挥着重要作用。在稻田进行干湿交替灌溉过程中，水稻根表也会形成铁膜。然而，干湿交替诱导水稻根表铁膜形成的生理与分子机理并不清楚。本文从铁膜的组成与影响因素出发，探讨了干湿交替影响根表红棕色铁膜形成的生理过程、根系基因差异表达谱和根表红棕色铁膜形成的分子机理。具体研究结果如下：
　　（1）化学分析表明，根表铁膜主要由无定型态和结晶态铁组成，占根表总铁的84％以上，且主要以Fe3+为主，占70%以上。正常磷处理条件下，水稻根表铁矿物主要以磷酸铁为主；缺磷处理条件下，水稻根表铁矿物主要以氧化铁或氢氧化铁为主。水稻根表铁膜由红棕色铁膜和非红棕色铁膜组成。磷素、特别是磷铁比显著影响根表红棕色和非红棕色铁膜的形成。当磷铁比小于1:3时，随着根际磷铁比的降低，根表红棕色铁膜数量增加。
　　（2）干湿交替促进根际氧化还原电位（Eh）的上升，Eh值从314.2 mV上升到529.5 mV；降低pH值，pH值从5.53下降到3.43；且干湿交替降低溶液中Fe2+浓度，其值从310.6μmol/L下降到31.5μmol/L。
　　（3）不同干湿交替强度和次数处理表明，干湿交替强度为12 h干旱和12 h淹水处理、且干湿交替处理5次时，水稻根系氧化力最大，达1036.73μg/h/g DW，比长期淹水对照增加了16.8%。干湿交替处理明显增加水稻根系抗氧化酶活性，随着干湿交替处理次数的增加，根系抗氧化酶活性如超氧化物岐化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）分别比对照增加了24.6-38.4%、22.2-27.1%、21.2-21.5%和3.6-10.4%；根系内源氧化性物质如超氧阴离子（O2-·）和过氧化氢（H2O2）含量分别比对照增加了14.5-30.0%和29.0-35.7%。
　　（4）为了研究H2O2在铁膜形成过程中的作用，研究了H2O2抑制剂（DMTU：二甲基硫脲，为H2O2清除剂；CAT：过氧化氢酶，为H2O2水解酶；AT：3-氨基-1，2，4-三唑，为CAT抑制剂）对水稻根表铁膜形成的影响。结果表明，DMTU处理的水稻根系内 H2O2含量、根系氧化力和根表DCB-Fe数量分别比不加抑制剂处理的相应值降低了27.2%、19.8%和18.4%；AT处理的水稻根系H2O2含量、根系氧化力和根表DCB-Fe数量则分别增加了31.8%、22.8%和26.7%；外源CAT添加处理降低了根表氧化性物质，DCB-Fe的数量减少了24.5%。
　　（5）为了探究H2O2的可能来源，我们对长期淹水（CK）、干湿交替（AWD）、长期淹水加Fe2+（CK+Fe）和干湿交替加Fe2+（AWD+Fe）处理条件下的水稻根系进行了基因差异表达谱分析。我们对四个数据库（AWD/CK、(AWD+Fe)/(CK+Fe)、(CK+Fe)/CK和(AWD+Fe)/AWD）进行聚类分析发现，有3822个差异表达基因参与了干湿交替和铁膜的形成过程。其中，AWD/CK（506上调和687下调）中的差异表达基因多于(AWD+Fe)/(CK+Fe)（308上调和179下调），表明铁膜形成后会恢复部分基因的表达水平。与AWD/CK和AWD+Fe/AWD处理相比，(CK+Fe)/CK（728上调和1175下调）和(AWD+Fe)/AWD（1252上调和1189下调）有较多的差异表达基因。
　　（6）利用GO（Gene Ontology）对四个数据库中差异表达基因进行功能分类，发现有270个差异表达基因参与了氧化还原反应过程，165个差异表达基因与氧化还原酶功能有关。利用KEGG（KyotoEncyclopedia ofGenes andGenomes）对四个数据库中的差异表达基因进行生物通路富集分析，结果发现，差异表达基因主要分布在代谢通路、生物合成通路、光合作用通路、信号刺激通路和细胞器通路。利用维恩图分析差异表达基因的整体分布，发现四个数据库中有38个共同差异表达基因，这些基因的蛋白注释，表明它们与水稻抗病性、抗旱性、细胞壁和细胞膜、氧化还原、蛋白激酶和转运、新陈代谢过程有关。AWD与CK相比，氧化还原反应过程中差异表达基因最多，达102个基因，占总差异表达基因数的8.25%，其中30个基因上调表达，72个基因下调表达。荧光定量PCR结果与基因表达谱分析结果基本一致，两者的线性回归分析发现，其相关系数达到0.90。干湿交替处理促进了水稻根系乙醇酸氧化酶基因（OsGLO）的表达，水稻根系OsGLO3和OsGLO4表达量分别是对照的2.2倍和2.7倍，表明，OsGLO参与了氧化还原反应过程，OsGLO可能受干湿交替诱导。
　　（7）OsGLO生物信息学分析表明，OsGLO家族有6个成员，其中 OsGLO1、OsGLO3、OsGLO4和OsGLO5编码蛋白序列的保守结构域类似。除了OsGLO5外，OsGLO1、OsGLO3和OsGLO4的氨基酸序列和核酸序列相似性均大于70%，并且具有较高的同源性和较近的进化程度。OsGLO1和OsGLO4编码蛋白质的理化性质基本相似，且两者在各组织中的表达丰度相对较高。有趣的是，OsGLO4在水稻根和茎中表达丰度最高，是OsGLO1的1.36倍。因此，在下述试验中，我们选择了OsGLO4基因作为研究对象。
　　（8）为了研究OsGLO4基因在水稻根表铁膜形成过程中的影响，通过合作研究，我们获得了水稻OsGLO4基因的干涉材料（OsGLO4-RNAi）和超表达材料（OsGLO4-OX）。结果表明，在正常生长条件下，与WT相比，OsGLO4-RNAi水稻根系中OsGLO4基因表达量、乙醇酸氧化酶活性和DCB-Fe含量分别下降了35.6%、70.9%和16.5%。OsGLO4-OX水稻OsGLO4基因表达量、乙醇酸氧化酶活性和DCB-Fe含量分别上升了103.4%、101.6%和15.2%。利用GLC（乙醇酸，乙醇酸氧化酶促进剂）和HPMS（α-羟基-2-吡啶甲磺酸，乙醇酸氧化酶抑制剂）对OsGLO4-OX水稻根表铁膜进行研究，结果发现，与对照相比，GLC处理水稻根表铁膜数量增加了10.9%，HPMS处理水稻根表铁膜下降了29.7%，表明，水稻OsGLO4基因调控了根表铁膜的形成。
　　（9）另外，我们还研究了DMTU和AT对WT和OsGLO4-OX材料根表铁膜数量的影响。结果发现，与不加抑制剂处理相比，DMTU处理的WT和OsGLO4-OX材料根表DCB-Fe分别下降了17.5%和18.4%；AT处理水稻根表DCB-Fe分别增加了23.4%和25.7%。正常处理的水稻根系基部H2O2含量比根尖增加了72.6%，其CAT活性比根尖下降了32.3%，且根基部有大量红棕色铁膜，而根尖无明显红棕色铁膜出现；AT处理的水稻根系基部H2O2含量与根尖相比下降了28.0%，根基部红棕色铁膜明显少于根尖。随着干湿交替次数的增加，根系OsGLO4基因表达量逐渐增加，乙醇酸氧化酶活性最大增加了55.9%，H2O2荧光染色显示，干湿交替诱导了大量的H2O2在根表分泌，有趣的是，在水稻根尖和根系中柱细胞也发现大量H2O2的累积。
　　综上所述，干湿交替提高了水稻根系活力，提高根际Eh，降低溶液中的pH和Fe2+浓度，增加Fe2+的氧化，促进根表红棕色铁膜的形成，根表红棕色铁膜的形成是一个生物介导的根际生理与生化综合过程。干湿交替增加OsGLO4基因表达，增加乙醇酸氧化酶的活性，累积较多的H2O2，提高根系氧化力，OsGLO4基因促进了水稻根表红棕色铁膜的形成。

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第一章 前言

1.1 研究背景

1.2 研究目的和意义

1.3 研究的技术路线和内容

第二章 根表铁膜的组分及其影响因子的研究

2.1引言

2.2 材料与方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 干湿交替增强根系氧化力诱导根表铁膜形成的生理机理

3.1引言

3.2 材料与方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 干湿交替诱导水稻根表铁膜形成过程中的根系基因差异表达谱研究

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3 结果分析

4.4 讨论

4.5 小结

第五章 OsGLO基因的生物信息学分析及其诱导水稻根表铁膜形成的机理研究

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.3 结果分析

5.4 讨论

5.5 小结

第六章 全文讨论与结论

6.1 综合讨论

6.2 主要结论

6.3 创新点

6.4 展望

致谢

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表学术论文情况