建兰花叶病毒广东分离物分子特征与侵染性克隆构建

摘要

兰花(Cymbidium spp.)清幽脱俗极具观赏价值和收藏价值，近年来，随着社会的进步，兰花越来越受到人们的重视，同时，兰花也是是广东顺德等地的高效创汇产业。但是，病毒病严重危害着兰花产业的发展。兰花病毒病可造成兰花花叶、坏死以及花朵变色和畸形，严重影响其品质，其中建兰花叶病毒(CymMV)是造成兰花经济损失的主要病毒之一。
　　本研究获得了三个建兰花叶病毒分离物，分别标记为 CymMV-GDFS1、CymMV-GDFS2、CymMV-GDFS3。三个分离物基因组全长序列分别由6227、6222、6224个碱基组成，各包含5个开放阅读框，分别为4254bp的RdRp、702bp的TGB1、339bp的TGB2、276bp的TGB3、以及672bp的CP基因。对这三个分离物的的全基因组核苷酸序列相似性进行分析，结果表明CymMV-GDFS1与CymMV-GDFS2相似性最低为98.1％，CymMV-GDFS2与CymMV-GDFS3相似性为98.5%，CymMV-GDFS1与CymMV-GDFS3相似性最高为99.3%。与已报导的其它12个CymMV全长序列相比较，相似性在87.3%-97.3%之间；与 Hawaii的两个分离物 CymMV-18-30、CymMV-18-1的相似性都较低，分别为87.3%与88.5%；而与除此之外的其它10个分离物的相似性在96%-97.3%之间。这三个CymMV CP基因序列与54个国内CymMV CP序列相比较，核苷酸与氨基酸的相似性分别为86%-99%、91%-100%；与57个国外CymMV CP序列相比较，核苷酸与氨基酸的相似性分别为88%-99%、90.5%-100%。根据111个CymMV CP序列分别构建核苷酸和氨基酸系统进化树，核苷酸进化树分析表明 CymMV-GDFS1与 CymMV-FS4亲缘关系最近，而 CymMV-GDFS2、CymMV-GDFS3与CymMV-DEK30亲缘关系最近；氨基酸进化树表明CymMV-GDFS1与CymMV-FS4亲缘关系同样最近、CymMV-GDFS3与CymMV-ZH2亲缘关系最近、CymMV-GDFS2与CymMV-C-LZ02亲缘关系最近，而三个分离物之间亲缘关系较远。这三个分离物RdRp序列与已报导的12个CymMV RdRp序列相比较，相似性为87.3%-97.9%。
　　本研究通过分段克隆的方法将获得的三个CymMV分离物成功地连接到改造后的植物双元表达载体pCAMBIA2300，构建了含有CymMV病毒序列的侵染性克隆，通过农杆菌介导分别接种本生烟，接种40天后，本生烟表现病毒性的侵染症状，利用RT-PCR和ELISA都能从本生烟叶片中检测到CymMV。初步证明构建的侵染性克隆具有生物学活性，可以成功地侵染本生烟。
　　在构建侵染性克隆的基础上，通过酶切连接将绿色荧光蛋白GFP序列连接到含有CymMV病毒的侵染性克隆表达载体上。通过农杆菌介导瞬时表达分别接种本生烟，三天后用共聚焦显微镜观察本生烟叶片，发现病毒主要聚集在叶表皮细胞壁与细胞核周围。

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1 前言

1.1 兰花病害概述

1.2 建兰花叶病毒

1.2.1建兰花叶病毒引致的兰花症状

1.2.2广东建兰花叶病毒研究进展

1.2.3 建兰花叶病毒的基因组结构

1.2.4 建兰花叶病毒的遗传多样性

1.2.5 建兰花叶病毒检测方法

1.3 侵染性克隆研究

1.4研究目的意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 植物材料及病毒来源

2.1.2 主要试剂

2.1.3 菌种及载体

2.1.4 主要仪器及设备

2.1.5 主要试剂的配制

2.2 广东建兰花叶分离物的遗传多样性分析

2.2.1 RNA提取用具的处理

2.2.2总RNA的提取

2.2.3 RT-PCR扩增的引物

2.2.4 RT-PCR分段扩增CymMV全长和CP序列

2.2.5 RT-PCR产物的回收

2.2.6目的片段的TA克隆

2.2.7大肠杆菌JM109感受态的制备

2.2.8重组质粒的转化

2.2.9 重组质粒的抽提

2.2.10重组质粒的双酶切及序列测定

2.2.11序列分析

2.3建兰花叶病毒侵染性克隆构建

2.3.1植物双元表达载体pCAMBIA2300-35S 改造

2.3.2两个目的片段分别连接到pCAMBIA2300-JT

2.3.3农杆菌GV3101菌株感受态细胞的制备

2.3.4 电击转化

2.3.5农杆菌介导的植物接种

2.3.6侵染性克隆检测接种本生烟发病情况

2.4 瞬时表达

2.4.1三个分离物全长表达载体的构建

2.4.2 PCR扩增获得pCAMBIA1302上GFP到Nos间1037 bp目的条带

2.4.3农杆菌介导的植物接种

2.4.4观察接种后烟草GFP荧光变化情况

3 结果与分析

3.1 CymMV广东分离物的遗传多样性分析

3.1.1 RT-PCR分别获得CymMV分离物两个目的片段

3.1.2 CymMV分离物目的片段的克隆及重组质粒鉴定

3.1.3 CymMV序列分析

3.2 侵染性克隆构建

3.2.1 植物双元表达载体pCAMBIA2300-35S改造

3.2.2 CymMV分段连接到pCAMBIA2300-JT

3.2.3 CymMV全长重组质粒转化农杆菌GV3101

3.2.4 侵染性克隆检测接种本生烟发病情况

3.3瞬时表达

3.3.1 CymMV分离物全长表达载体的构建

3.3. 2 CymMV分离物全长瞬时表达观察病毒在本生烟的移动

3.3. 3 CymMV分离物全长瞬时表达荧光观察

3.3. 4 CymMV分离物全长与GFP序列连接侵染烟草症状观察

3.3. 5 CymMV分离物全长与GFP序列连接侵染烟草RT-PCR验证

4 结论与讨论

4.1 CymMV遗传多样性分析

4.3结论

4.4 进一步需要解决的问题

致谢

参考文献

附录