上海某猪场大肠杆菌中mcr-1基因的传播机制研究

摘要

近年来由于多耐药革兰阴性菌的广泛流行，尤其是碳青霉烯耐药革兰阴性菌株的不断出现，使得黏菌素这一老药被重新用于治疗这些多重耐药菌，不幸地是，黏菌素耐药现象也变得越来越严重。多粘菌素的耐药往往是由染色体突变造成的，而最近出现了质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1，自报道之后，mcr-1基因成为研究热点。本研究对首次发现mcr-1基因的上海某猪场大肠杆菌进行mcr-1基因检测，以进一步研究该猪场的mcr-1流行情况和传播机制，为控制mcr-1基因的扩散提供理论依据。
　　对2013年7月份分离自上海市某猪场的47株大肠杆菌采用PCR方法检测mcr-1基因，结果有27株（57.4％）多粘菌素不敏感且全部检测到mcr-1基因，说明了该猪场大肠杆菌对黏菌素耐药机制主要由mcr-1介导。
　　采用琼脂稀释法测定mcr-1阳性大肠杆菌对抗菌药的敏感性，结果表明27株mcr-1阳性菌对氨苄西林的耐药率为77.8%（21/27），对头孢噻肟的耐药率为33.3%（9/27），对磷霉素的耐药率为25.9%（7/27），对氯霉素、氟苯尼考、复方新诺明的耐药率均达到100%，表明所有菌株都呈现不同程度的多重耐药现象。所有阳性菌株对阿米卡星和亚胺培南均敏感。
　　通过脉冲场凝胶电泳（PFGE）方法研究mcr-1阳性大肠杆菌间的克隆传播关系。PFGE分型结果发现26株分型成功，1株分型失败，26株分型成功的可以分为A-S这19个型，表明大部分mcr-1阳性大肠杆菌不存在克隆传播关系。
　　对27株mcr-1阳性大肠杆菌进行接合转移试验以研究质粒的可转移性，结果有22株成功接合，其中有2株各获得2株不同接合子，5株多次接合均失败。对获得的24株接合子进行复制子分型，分别有9、6、4、2株为IncX4、IncHI2、IncI2、IncF型质粒，其他3株分别为IncY、IncHI2和IncY、F:2 A-B:53和IncX4型，表明携带mcr-1的质粒丰富多样。采用PCR方法检测接合子中其他耐药基因的携带情况，发现5株IncHI2型质粒同时检测到blaCTX?M?14、fosA3、oqxAB和floR，1株IncHI2型质粒检测到blaCTX?M?14、fosA3和floR，还有1株IncHI2型质粒检出blaCTX?M?15、fosA3、oqxAB和floR，说明IncHI2型质粒往往携带blaCTX?M、fosA3、oqxAB和floR耐药基因与mcr-1共同传播。
　　采用PCR-mapping方法对mcr-1基因上下游侧翼序列进行分析，共发现了3种不同类型的基因环境，其中有7株在mcr-1基因的上游检测到了插入序列ISApl1，有6株在mcr-1的上下游均检测到了ISApl1，其他14株在mcr-1的上下游均未测到ISApl1。
　　对24株携带mcr-1基因的大肠杆菌接合子和5株阳性原菌进行S1-PFGE并与mcr-1探针进行Southern杂交。结果显示，IncX4型质粒大小约为28.8～33.3kb，IncI2型质粒大小约为54.7～78.2kb，IncY型质粒大小约为78.2kb，IncHI2型质粒大小约为216.9～-244.4kb，F29型质粒大小约为54.7kb，F53型质粒大小约为138.9kb，未接合成功的5株原菌中有1株的mcr-1基因位于染色体上，其他均位于质粒上，其中1株质粒大小约为28.8～33.3kb，1株质粒大小约为244.4～310.1kb，其他2株质粒大小约为78.2～104.5kb。
　　本研究结果表明，mcr-1基因在该猪场广泛传播，主要通过IncHI2、IncX4和IncI2型质粒进行传播，携带mcr-1的IncHI2型质粒往往同时携带blaCTX?M、fosA3、oqxAB和floR等耐药基因共同传播。因此，我们应该对这个新发现的黏菌素耐药基因mcr-1给予高度的重视。

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1 前言

1.1 黏菌素及耐药现状概述

1.2 黏菌素耐药机制研究

1.3 mcr-1的首次发现和流行情况概述

1.4 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结果与分析

3.1 耐药基因mcr-1的PCR检测结果

3.2 药物敏感性试验结果

3.3 其他耐药基因的检测结果

3.4 mcr-1阳性菌的基因环境检测结果

3.5 mcr-1阳性菌的PFGE结果

3.6 接合转移试验结果

3.7 mcr-1阳性接合子复制子分型结果

3.8 S1-PFGE及Southern杂交结果

4 讨论与结论

4.1 黏菌素在临床的应用和耐药现状分析

4.2 mcr-1阳性接合子复制子分型分析

4.3 mcr-1阳性大肠杆菌的基因环境分析

4.4 质粒介导的mcr-1与其它耐药基因携同传播机制分析

4.5 全文总结

致谢

参考文献

附录