转录因子MaAP2a-1和MabHLH6调控采后香蕉果实淀粉降解的作用及其机制研究

摘要

香蕉是典型的呼吸跃变型果实，果实在采前发育过程中不断积累淀粉，采后成熟进程中其一旦乙烯开始释放，淀粉迅速降解，转化为可溶性糖，果实明显软化。香蕉贮藏淀粉的降解为香蕉一系列的采后成熟活动提供能量基础。虽然淀粉降解研究在模式植物拟南芥叶片和谷物种子中已经被深入研究，但是在淀粉型果实，特别是香蕉果实采后成熟进程中的淀粉降解还存在很多未知。
　　在拟南芥中，在GWD1和PWD的磷酸作用下，葡聚糖可以被水解酶部分水解，接着在 SEX4及 LSF1\2去磷酸作用下，葡聚糖得以彻底水解且产物被转运出质体。依据拟南芥的模式，本论文在香蕉基因组中一共发现38个淀粉降解相关酶基因（葡聚糖磷酸激酶（MaGWD、MaGWD2和MaPWD1），磷酸葡聚糖去磷酸酶（MaSEX4、MaLSF1和 MaLSF2），β-淀粉酶（ MaBAM1-MaBAM11）α-淀粉酶（ MaAMY2A、MaAMY2B、MaAMY2C、MaAMY3、MaAMY3A、MaAMY3B和MaAMY3C），淀粉去分支酶（MaISA1-MaISA3），α-葡聚糖磷酸化酶（MaPHS1和 MaPHS2），淀粉歧化酶（MaDPE1和MaDPE2），麦芽糖转运蛋白（MaMEX1和MaMEX2），葡萄糖转运蛋白（MapGlcT1、MapGlcT2-1、MapGlcT2-2、MapGlcT4-1和MapGlcT4-2）），研究了这些基因在香蕉果实采后成熟过程中的表达特征，同时探讨了转录因子 MaAP2a-1和MabHLH6在调控香蕉果实淀粉降解的作用及其机制，获得了以下结果：
　　1．香蕉采后成熟过程中，淀粉含量下降，可溶性糖含量升高，与果实软化和乙烯的释放高度一致；同时，扫描电镜 SEM结果显示，淀粉粒表面由光滑变成平行的凹槽，说明果实成熟过程中存在酶降解淀粉。
　　2．在香蕉基因组中发现了38个参与香蕉果实淀粉降解的候选基因，研究了这些基因的表达特征。表达分析结果显示，有27个候选基因（MaGWD1、MaPWD1、MaSEX4、MaLSF1、MaLSF2、MaBAM1-MaBAM4、MaBAM6-MaBAM8、MaBAM10、MaAMY2B、MaAMY2C、MaAMY3、MaAMY3A、MaAMY3C、MaISA2、MaISA3、MaPHS2、MaMEX1、MaMEX2、MapGlcT2-1、MapGlcT2-2，MapGlcT4-1和MapGlcT4-2）在果实成熟中被明显诱导，并且与淀粉转化为可溶性糖的过程一致。相反, MaGWD2、MaAMY2A、MaBAM9、MaPHS1、MaDPE1、MaDPE2和MapGlcT1受乙烯影响，转录水平下降。另外，MaAMY3B、MaBAM5和MaBAM11表达不规律， MaISA1转录水平没变化。
　　3 iTRAQ基础蛋白组学实验分析结果显示：有18个淀粉降解相关酶基因结合到淀粉粒表面，其中有10个蛋白（MaGWD1、MaPWD1、MaSEX4、MaLSF1、MaBAM4、MaBAM7、MaAMY2B、MaAMY2C，MaAMY3和MaISA3）响应果实成熟，蛋白水平表达上升； iTRAQ和Western blot分析淀粉粒表面蛋白结果说明MaGWD1定位在淀粉粒表面，并在果实成熟过程中，蛋白在淀粉粒表面积累上升。成熟乙烯能诱导MaGWD1启动子活性，推测MaGWD1在乙烯启动果实淀粉降解中起到重要作用。
　　4．通过酵母单杂交Y1H筛库，得到能结合MaGWD1启动子的一个AP2转录因子MaAP2a-1和一个bHLH转录因子MabHLH6。MaAP2a-1在成熟过程中，转录水平和蛋白水平都受乙烯下调表达，而 MabHLH6正好相反。烟草瞬时表达实验证实MaAP2a-1是具有EAR转录抑制区的转录抑制子，MabHLH6是转录激活子且果实成熟乙烯诱导MabHLH6启动子活性。
　　5．EMSA和Chip-qPCR以及瞬时表达实验发现，MaAP2a-1能通过结合15个淀粉降解基因（MaGWD1、MaPWD1、MaSEX4、MaLSF1、MaBAM1-MaBAM3、MaAMY2B、MaAMY2C、MaAMY3A、MaAMY3C、MaMEX1、MaMEX2，MapGlcT2-1和MapGlcT2-2）的启动子元件（GCC-box或 AT-rich），抑制这些基因的转录。同时研究还发现， MabHLH6能识别11个淀粉降解基因（MaGWD1、MaLSF2、MaBAM1、MaBAM2、MaBAM8、MaBAM10、MaAMY3、MaAMY3C、MaISA2，MaISA3和MapGlcT2-2）启动子元件（E-box）并激活启动子活性。

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第一章 综述

1.1 植物淀粉降解研究进展

1.2 APETALA2（AP2）类转录因子研究进展

1.3 bHLH类转录因子功能研究进展

1.4 本论文研究的目的和意义

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3结果与分析

2.4讨论

2.5本章小结

第三章 转录因子MaAP2a-1和MabHLH6调控香蕉淀粉降解机理分析

3.1引言

3.2材料与方法

3.3结果与分析

3.4 讨论

3.5 本章小结

结论与推论

致谢

参考文献

附录

附录A

附录B