南方野生稻内生细菌的分离鉴定及促生作用

摘要

野生稻是栽培稻的祖先，是一种重要的种质资源，也是宝贵的功能微生物资源库。野生稻内生细菌具有丰富的多样性，为丰富微生物肥料菌种储备库，为菌肥菌种的选育提供依据，本研究以南方野生稻（Oryza meridionalis）为分离材料，采用DN和CCM两种无氮培养基并结合平板划线法对南方野生稻内生细菌进行分离纯化；通过乙炔还原法检测菌株的固氮酶活性，对菌株固氮nifH基因扩增，用分子技术进一步确定其固氮活性，以此对内生固氮菌进行筛选；采用IS-PCR指纹图谱、SDS-PAGE全细胞蛋白电泳对分离到的内生细菌进行聚类分析；根据16S rRNA基因序列分析确定各个类群代表菌株的分子系统发育关系；使用透明圈法检测内生细菌的溶磷解钾能力；Salko wski比色法检测各菌株产生长素能力；采用2，4-二硝基苯肼比色法定量检测菌株是否具有1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）脱氨酶活性；采用络天氰（CAS）法检测菌株是否具有产铁载体特性；对筛选到的高效内生固氮菌进行水稻盆栽试验，研究其对水稻的促生作用；研究结果如下：
　　（1）野生稻内生细菌物种丰富，本研究从南方野生稻中共分离到58株内生细菌，IS-PCR指纹图谱与SDS-PAGE将58株内生细菌聚为11个类群，各个类群代表菌株16S rRNA基因序列分析表明：类群I代表菌株JH01与Kosakonia（Kosakonia sacchari SP1T）相似性为99.17%；类群II代表菌株JH05鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas trueperi LM G2142T）相似性为99.88%；类群III代表菌株JH10与伯克霍尔德菌（Burk holder ia contaminansLMG23361T）相似性为100%；类群IV代表菌株JH14与芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai B8W22T）相似性为100%；类群 V代表菌株JH18与根瘤菌（Rhizobium pusense NRCPB10T）相似性为100%；类群VI代表菌株JH25与克雷伯氏菌亚种（Klebsiella pneumoniae subsp.rhinoscleromatis ATCC13884T）相似性为99.76%；类群VII代表菌株JH37与单胞菌（Brevundimonas aurantiacaDSM4731T）相似性为99.88%；类群VIII代表菌株JH40与柠檬酸杆菌（Citrobacter bitternisSKKUI-TP7T）相似性为99.32%；类群IX代表菌株JH46伯克霍尔德菌（Burkholderia vietnamiensisLMG10929T）相似性为99.88%；类群X代表菌株JH50与草螺菌（Herbaspirillum seropedicae DSM6445T）相似性为99.65%；类群XI代表菌株JH58与根瘤菌（Rhizobium radiobacter ATCC19358T）相似性为99.88%，表明南方野生稻内生细菌具有多样性，为微生物肥料生产收集了菌种资源。
　　（2）通过对58株内生细菌进行乙炔还原法检测及固氮酶nifH基因的扩增发现58株内生细菌中共有37株具有固氮酶活性，固氮酶活性分布在14.82～494.14nmol·mL-1h-1之间，其中JH40、JH50的固氮酶活性最高，分别为360.61nmol·mL-1h-1、494.14nmol·mL-1h-1。
　　（3）分离获得2个类群代表菌株JH40和JH50，为柠檬酸杆菌和草螺菌，JH40、JH50具有固氮酶活性，能溶磷解钾，同时也能分泌吲哚乙酸，具有产铁载体和产ACC脱氨酶的能力，JH40、JH50产吲哚乙酸能力27.84mg·L-1、29.97mg·L-1；ACC脱氨酶活性为24.76μmol·mg-1·h-1、22.94μmol·mg-1·h-1。
　　（4）发现柠檬酸杆菌可以分泌铁载体，具有固氮、解钾、ACC脱氨酶能力；对柠檬酸杆菌进行水稻盆栽促生试验，发现其可以促进水稻生长。
　　（5）对JH40、JH50进行水稻盆栽试验，发现都能促进水稻生长，其中鲜重分别增加了32.97%、40.99%，干重分别增加了63.06%、64.22%，株高、穗长、分蘖数都有明显差异。
　　以上结果说明，JH40、JH50具有较强的促生能力，在促进水稻生长方面具有较强的潜力，可以作为微生物肥料储备菌种，并有望在绿色农业发展中发挥促进作用。

目录

声明

1 前言

1. 1 植物内生细菌的概念及研究

1. 2 植物内生细菌的分类鉴定

1. 3 植物内生细菌的功能

1. 4 植物内生细菌的应用前景

1. 5 植物内生细菌实际应用中存在的问题

1. 6 选题依据和意义

1. 7 研究内容

1. 8 技术路线

2. 1 试验材料

2. 2 试验方法

2. 3 主要试验仪器和数据处理方法

3 结果与分析

3. 1 内生细菌的分离纯化

3. 2 内生细菌固氮酶活性的测定

3.3 固氮酶nifH基因的扩增

3. 4 内生细菌聚类鉴定分析

3. 5 菌株促生特性分析

4 讨论与结论

4. 1 野生稻内生细菌的多样性

4. 2 内生细菌功能多样性

4. 3 内生细菌促生作用

4. 4 展望

4. 5 结论

致谢

参考文献