狂犬病病毒GD-SH-01株P蛋白对血脑屏障通透性的影响

摘要

狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）引起的急性致死性脑炎，一旦出现临床症状，死亡率几乎能达到100%。狂犬病作为目前世界流行广泛的人兽共患病，虽然人们已认识到了它的危害，但每年仍然导致超过55,000人死亡。目前，控制狂犬病以注射疫苗为主。因此，为了研发更高效的疫苗，充分认识狂犬病病毒各基因对机体的作用有着重大意义。
　　血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）作为外周循环和中枢神经系统（central nerves system,CNS）之间的有机屏障，起着维持脑内环境稳定和避免有害物质进入中枢神经系统的作用。通常，血脑屏障由紧密连接蛋白（tight junction protein）将血管上皮细胞连接在一起形成致密的屏障结构。但微生物的产物能造成血脑屏障的破坏，从而导致血脑屏障通透性升高。所以在临床上，血脑屏障一方面能保证中枢神经系统不受外周有害物质的侵袭，另一方面它也阻碍了治疗性物质进入中枢神经系统，加大了治疗神经性疾病的难度，而对于狂犬病病毒，尚无关于每个结构基因对血脑屏障影响的研究。
　　在本研究中，我们将狂犬病病毒强毒株GD-SH-01株、弱毒株HEP-Flury、以及HEP-Flury五个结构基因被GD-SH-01替换的重组毒株rHEP-SH-N、rHEP-SH-P、rHEP-SH-M、rHEP-SH-G和rHEP-SH-L感染小鼠，我们发现，在感染后第9天，两株亲本毒株和重组毒株rHEP-SH-N、rHEP-SH-M、rHEP-SH-G和rHEP-SH-L的小鼠血脑屏障通透性都有不同程度的增强并且发病，只有rHEP-SH-P感染的小鼠血脑屏障通透性几乎不变，并且小鼠几乎不发病。为探究其原因，我们先检测了感染亲本毒株和rHEP-SH-P的小鼠的紧密连接蛋白的表达水平，发现rHEP-SH-P感染小鼠的紧密连接蛋白表达水平比亲本株感染的小鼠都要高。
　　接着，通过qRT-PCR检测了rHEP-SH-P、HEP-Flury和GD-SH-01三株病毒P基因和N基因的表达水平，我们发现rHEP-SH-P的P基因表达受到抑制，导致N基因的表达也受到抑制，说明其复制能力不如亲本毒株。而通过检测体内的病毒载量，我们发现rHEP-SH-P的病毒载量显著高于亲本毒株，以及通过免疫组化（IHC）发现rHEP-SH-P感染的小鼠脑中T细胞浸润量要低于亲本株，这说明由于rHEP-SH-P的感染能维持血脑屏障的完整，从而外周淋巴细胞无法进入中枢神经系统及时清除病毒，导致病毒含量高。最后，我们检测了感染三株病毒后，小鼠脑中的炎症炎症因子表达量，我们发现rHEP-SH-P诱导的炎症反应不如亲本毒株GD-SH-01。
　　综上所述，GD-SH-01的P基因的表达在HEP-Flury的基因骨架上受到抑制，从而病毒复制水平降低，导致致病性降低以及诱导炎症反应的能力降低，因此维持BBB的完整性，说明病毒的复制能力是诱导炎症反应的关键因素。

目录

声明

英文缩略词或符号表

1 前言

1. 1 狂犬病概况

1. 2 狂犬病病毒特征

1. 3 血脑屏障的特征

1. 4 狂犬病病毒对血脑屏障影响的研究进展

1. 5 研究目的与意义

1. 6 研究方法与技术路线

2. 1 材料

2. 2 方法

3. 1 病毒滴度的测定

3.2 重组狂犬病病毒rHEP-SH-N对血脑屏障通透性影响

3.3重组狂犬病病毒rHEP-SH-P对血脑屏障通透性影响

3.4 重组狂犬病病毒rHEP-SH-M对血脑屏障通透性影响

3.5 重组狂犬病病毒rHEP-SH-G对血脑屏障通透性影响

3.6重组狂犬病病毒rHEP-SH-L对血脑屏障通透性影响

3. 7重组狂犬病病毒及亲本毒株对成鼠体重及状态的影响

3.8 Western blot检测TJ蛋白的表达水平

3. 9 P基因替换毒株与亲本毒株P基因的转录水平

3. 10病毒在体内复制能力

3. 11体内病毒载量的检测

3. 12病毒感染后免疫细胞浸润中枢神经系统

3. 13q RT-PCR检测体内细胞因子表达水平

4 讨论

4. 1 狂犬病病毒诱导机体免疫反应的差异

4. 2 基因替换对病毒的影响

4. 3 细胞因子与血脑屏障的关系

4. 4影响狂犬病病毒致病性的因素

4. 5 T细胞在狂犬病病毒感染中的作用

5结论

6展望

致谢

参考文献

附录：硕士期间发表文章