玫烟色棒束孢cDNA文库的构建及与小菜蛾Serpin基因的互作因子筛选

摘要

小菜蛾Plutella xylostella是十字花科蔬菜上的主要害虫之一，因长期、大量使用广谱性化学杀虫剂，小菜蛾对常用的许多杀虫剂产生了较强的抗药性。玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea作为一类重要的昆虫病原真菌可有效地控制小菜蛾种群数量的增长。有研究表明玫烟色棒束孢分泌的类枯草杆菌丝氨酸蛋白酶、丝氨酸类胰蛋白酶、几丁质酶、抗菌肽类等蛋白酶参与了菌体对宿主的侵染；感染玫烟色棒束孢后，小菜蛾体内Serpins基因的表达量明显上调；这表明玫烟色棒束孢在侵染小菜蛾的过程中存在着致病基因与受体基因间的识别、免疫互作关系。本论文通过利用酵母双杂交技术，构建由小菜蛾诱导的玫烟色棒束孢酵母双杂交cDNA文库，以小菜蛾Serpin基因编码的蛋白为诱饵，利用酵母双杂交技术，以期从cDNA文库中筛选出与诱饵蛋白相互作用的蛋白及其相对应的功能基因，明确玫烟色棒束孢与小菜蛾间的互作关系。
　　（1）玫烟色棒束孢酵母双杂交cDNA文库的构建与检测
　　以小菜蛾为诱导物、培养玫烟色棒束孢菌丝一定时间后，抽滤菌丝并提取菌丝的总RNA，根据Clontech公司的Make Your Own“Mate & PlateTM”Library System试剂盒的操作指南，以反转录的cDNA为模板经LD-PCR扩增获得双链cDNA；将双链cDNA和pGADT7-Rec载体通过同源重组方式共转化到Y187酵母感受态中，获得玫烟色棒束孢酵母双杂交cDNA文库。检测结果表明：文库中插入片段的长度在300～2000bp之间、转化效率为2.2×106cfu/3μg pGADT7-Rec、重组率为100%、库容为2.2×106cfu、滴度为3.12×107cfu/mL。这些数据表明所构建的玫烟色棒束孢酵母双杂交cDNA文库的质量较高，可应用于互作蛋白的筛选。
　　（2）诱饵质粒pGBK T7-Serpin的构建及其自激活效应和毒性检测
　　抽提经玫烟色棒束孢侵染的小菜蛾总RNA，以反转录的cDNA为模板，用特异性引物扩增Serpin基因，构建pGBKT7-Serpin诱饵表达载体，将其与空载体pGBKT7分别转入Y2HGold酵母感受态中，观察菌落在不同筛选培养基上的生长状况，检测Serpin基因表达的诱饵蛋白的毒性及其在质粒载体中的自激活效应。结果表明：带pGBK T7-Serpin诱饵质粒的重组酵母在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal营养缺陷型培养基上能正常生长、其菌落为白色，在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA营养缺陷型培养基上无菌落生长，表明诱饵基因在质粒载体中无自激活性；在SD/-Trp营养缺陷培养基上，分别转入pGBKT7-Serpin诱饵质粒和pGBKT7质粒的两种重组酵母的菌落大小及数目基本相同。上述结果表明Serpin基因表达的诱饵蛋白无毒性，带pGBK T7-Serpin诱饵质粒的重组酵母可与cDNA文库进行酵母双杂交。
　　（3）cDNA文库中与Serpin基因表达蛋白的互作蛋白及其对应基因的筛选
　　根据Clontech公司的MatchmakerTM Gold Yeast Two-Hybrid操作说明，将pGBKT7-Serpin诱饵菌株与cDNA文库进行杂交，利用缺陷型培养基筛选相互作用的阳性菌落。结果表明：在显微镜下可观察到类似三叶草状二倍体细胞，说明酵母双杂交成功；对蓝色的酵母菌落进行PCR鉴定、测序，获得与Serpin蛋白相互作用蛋白的编码序列，为后续玫烟色棒束孢与小菜蛾的互作研究奠定了基础。

目录

声明

1 前言

1. 1玫烟色棒束孢的研究现状

1.1.1 玫烟色棒束孢的生物学特性

1.1.2玫烟色棒束孢对寄主的侵染过程

1.1.3玫烟色棒束孢的分子生物学研究

1.1.4玫烟色棒束孢在生物防治中的应用

1. 2 小菜蛾的抗性机理研究

1.2.1 小菜蛾的抗药性机理研究

1.2.2 小菜蛾的免疫机制研究

1.3 Serpins 的研究现状

1.3.1 Serp ins 的结构及作用机制

1.3.2 Serp ins在昆虫免疫中的作用及研究

1. 4酵母双杂交的研究进展

1. 5 研究目的及意义

2 玫烟色棒束孢酵母双杂交cDNA文库的构建与检测

2. 1材料和方法

2.1.1主要仪器、设备

2.1.2 实验材料与试剂

2.1.3 玫烟色棒束孢菌丝总RN A的提取

2.1.4cDNA第一条链的合成

2.1.5 双链cDNA的合成与纯化

2.1.6 双链cDNA与载体的同源重组及转化

2.1.7 收获克隆

2.1.8 文库质量鉴定

2. 2结果

2.2.1 玫烟色棒束孢菌丝总RN A的制备

2.2.2 ds cDNA的制备

2.2.3 cDNA文库的制备

2.2.4 cDNA文库的检测

2. 3讨论

3 诱饵质粒pGBKT7-Serpin的构建及其自激活效应和毒性检测

3. 1材料与方法

3.1.1 主要仪器、设备

3.1.2 实验材料与试剂

3.1.3诱饵质粒的构建与鉴定

3.1.4 诱饵质粒的自激活效应与毒性检测

3. 2结果

3.2.1 诱饵质粒pGBKT7-Serpin的构建与鉴定

3.2.2诱饵质粒pGBKT7-Serpin的自激活效应检测

3.2.3 诱饵质粒pGBKT7-Serpin的毒性检测

3. 3讨论

4 cDNA文库中与Serpin基因表达蛋白的互作蛋白筛选

4. 1材料与方法

4.1.1主要仪器、设备

4.1.2 实验材料与试剂

4.1.3用pGBK T7-Serpin诱饵菌株从酵母双杂交cDN A文库中筛选互作蛋白

4.1.4 阳性菌落的筛选与鉴定

4. 2 结果

4.2.1杂交二倍体形态检测

4.2.2杂交效率检测

4.2.3所筛二倍体菌落数计算

4.2.4 酵母双杂交阳性菌落的筛选

4.2.5 酵母双杂交阳性菌落的鉴定

4. 3 讨论

5 本论文的创新之处

6 进一步研究设想

致谢

参考文献