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鸡骨骼肌发育过程中miRNA及其靶基因的特性描述

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List of commonly used abbreviations

1. Introduction

1.1 Differential miRNAs

1.2 Developmental hypothesis

2. Materials and methods

2.1 Chicken embryo incubation and tissue collection

2.2 Total RNA isolation and reverse transcription

2.3 Identification of differentially expressed miRNAs

2.4 Differentially expressed miRNAs and genes network construction

2.5 Analysis of miRNA quantification by RT-PCR

2.6 Determination of mRNA levels by RT-PCR

2.7 Bioinformatics analysis

2.8 Plasmid construction

2.9 Predict the target gene CPEB3 and FGFR3 mutant 3'UTR amplification primers

2.10 Cell culture and Luciferase reporter assays

2.11 Statistical analysis

3. Results

3.1 Analysis of Small RNAs

3.2 Identification of known and novel miRNA

3.3 miRNAs expression and differentially significant expressed miRNAs

3.4 Identifying mRNAs expression and differentially expressed mRNAs

3.5 Integrated analysis of differentially expressed genes and miRNAs

3.6 qPCR validation of sequencing data

3.7 Target genes prediction, GO and KEGG analysis

3.8 KEGG pathway enrichment analysis

3.9 Verification of the interaction between miRNA and target gene

4. Discussion

4.1 miRNA target validation

4.2 miRNA and mRNA interaction in skeletal muscle

5. Conclusion and future prospects

致谢

参考文献

Appendix

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摘要

微小RNA(miRNA)是非编码RNA,可通过降解 mRNA分子或抑制它们的翻译来调节mRNA的表达。为了探究骨骼肌发育的分子机制,我们通过分析鸡骨骼肌发育过程中的差异表达基因和 miRNAs,根据 miRNA靶基因预测结果构建它们之间的互作网络,并对差异表达(|log2foldchange|≥1.75,P<0.005)的基因和miRNAs进行整合分析结果显示:E11-Vs-E16、E11-Vs-P1和 E16-Vs-P1比较组中分别鉴定出475个(201个上调,274个下调)、492个(199个上调,293个下调)和493个(192个上调302个下调的)差异表达的miRNAs。同时也在以上三组中分别鉴定了1968个(上调1048个,下调920个)、3249个(1647个上调,1602个下调)和1525个(774个上调,751个下调)差异表达的mRNAs。MiRNA-mRNA整合分析显示整合分析显示小部分miRNAs可调节众多的mRNAs。在 E11-Vs-E16、E11-Vs-P1和 E16-Vs-P1比较中,以|log2fold change|>1和P<0.05为标准,分析筛选出51、77和29个显著差异表达的miRNAs。另一方面,我们发现了三个重要的miRNAs(gga-miR-205a、gga-miR-1a-3p和gga-miR-499-3p),它们在三个比较组中均差异表达。通过体外功能试验通过体外功能试验分析显示:DF-1细胞中过表达 miR-222a和 miR-126-5P分别显著降低了它们的靶基因CPEB3和FGFR3的表达水平。miRNA和mRNA定量验证结果与测序结果类似。此外,对负相关的miRNA-靶基因对进行GO富集分析是预测miRNA在骨骼肌发育中的功能的重要方法。在E11-Vs-E16比较组中,差异表达基因主要与肌肉维持、成肌细胞增殖和肌肉细丝相关。在E11-Vs-P1比较组中,差异表达基因主要与肌肉发育相关的通路,包括轴突延伸的负调节、肌节组织细胞氧化还原稳态和激酶抑制剂活性相关。在E16-Vs-P1比较组中,差异表达基因主要与抗细胞凋亡肾小球、基底膜发育和轴突延伸负调节的负调控相关。三个比较组的KEGG通路分析结果表明,这些差异表达基因在氧化磷酸化、丙酮酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成和wnt信号通路中均有显著的富集。

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