草鱼呼肠孤病毒分子流行病学、全基因组序列及流行株灭活疫苗研究

摘要

由草鱼呼肠孤病毒（Grass Carp Reovirus，GCRV）引起的草鱼出血病给我国草鱼养殖造成了巨大的经济损失，GCRV是我国第一个分离到的水生呼肠孤病毒，也是水生呼肠孤病毒中毒力最强，危害最大的病原，GCRV的基因组是分11个节段的双链RNA病毒，变异迅速和复杂的病原学及缺乏有效的防控措施是导致其广泛、快速、持续的流行主要原因。疫苗免疫是当前防治草鱼出血病最为有效的措施，但GCRV病原学复杂，毒株类型众多，各地流行株型不清楚，疫苗的研制和应用均没有针对性，导致免疫失败的现象时常发生。开展草鱼呼肠孤病毒的分子流行病学调查，弄清不同地区草鱼呼肠孤病毒的流行病学情况，根据不同地域的流行毒株，研制有针对性的适合不同区域使用的疫苗是当前草鱼出血病防控的关键。GCRV的基因组经聚丙烯酰胺凝胶电泳呈现特定电泳带型，电泳带型和与其基因分型、基因组特征之间存在密切关系，因此，对不同电泳带型的GCRV代表株进行全基因组序列分析，对深入了解GCRV遗传变异历程和强、弱毒株的分子差异具有重要意义。因此，本研究的主要内容包括以下3个方面：
　　（1）草鱼呼肠孤病毒分子流行病学调查
　　采用三重RT-PCR分型检测技术对2011至2016年6年时间采集自江西、广东、广西、山西、山东、湖南，湖北、重庆、天津等18个省市各地的未发病草鱼样品2274份和疑似草鱼出血病样品366份样品进行GCRV分型检测，并对各毒株的S7基因进行序列和遗传进化分析，系统比较GCRV各分离株的分子流行病学特征、地域和时间分布差异及遗传进化关系，建立我国草鱼出血病分子流行病学数据库。结果显示，未发病草鱼样品共检测到65份阳性，总阳性率为2.9%，其中I型和I,II型混合感染各2份，II型61份,占整个阳性样品的93.8%，未检测到III型GCRV；疑似草鱼出血病样品检测到146份阳性，总阳性率为40%，其中I型8份，占总阳性样品的5.5%，II型131份,占总阳性样品的89.7%；I，II型混合感染5份，III型2份。可见，GCRV II型是我国当前主要流行基因型。各分离株S7节段序列分析发现，I、II和III型GCRV各分离株S7节段核苷酸和氨基酸序列的同源性分别在90%至99%、95%至100%和99%以上，基于S7基因节段构建的遗传进化树表明我国的GCRV总体上可以分为3个基因型，其中GCRV II型又可以分为不同的亚型，且GCRV不同分离株遗传进化树没有明显的时间和地域分布规律。
　　（2）不同电泳带型GCRV全基因组序列分析
　　对21株GCRV新分离株的基因组进行SDS-PAGE电泳带型分析，然后对电泳带型有差异的5株代表株进行全基因组测序，并同其它已知的GCRV进行基因组序列和特征比较，分析不同分离株各节段的核苷酸和氨基酸序列同源性及遗传进化关系。结果表明，21株GCRV分离株的SDS-PAGE电泳带型共分为3大类，带型相似同一大类的一些分离株带型也存在一定的差异。对不同带型的分离株全基因组序列分析发现，基因组带型不同类的分离株其核苷酸和氨基酸序列的同源性均小于50%，而基因组带型相似只是分布位置有微小差异的不同分离株，其核苷酸和氨基酸序列的同源性均在90%以上，且带型差异越大，序列的同源性和基因组特征差异也越大。基因组特征分析表明，3’和5’末端保守序列、非编码区长度、倒置重复序列及一些特殊结构均与基因组带型有关，带型相似的不同分离株之间的这些特征都相似，反之则差异较大。进一步分析发现，各分离株之间的基因带型差异、序列差异、基因组特征差异等，与分离的地域和时间没有明显相关性。系统进化分析表明，基于不同分离株的11节段的核苷酸和氨基酸序列构建的遗传进化树存均聚为3大类，说明目前我国的GCRV共有3个基因型。
　　（3）GCRV流行株型灭活疫苗研究
　　分子流行病学调查结果显示，GCRV II型是当前导致草鱼出血病流行与爆发的主要病原，开展GCRVII型疫苗研制对草鱼出血病的防控具有至关重要的意义。本研究以流行的GCRV II型新分离株GCRV-HuNan1307为研究对象，首先采用PSF细胞大量扩增该病毒，并用不同灭活剂和灭活温度对该病毒的灭活效果及灭活后疫苗的免疫效果进行评价，筛选出最佳灭活条件，制备HuNan1307株灭活疫苗；其次是以HuNan1307灭活疫苗腹腔注射免疫草鱼，然后通过监测免疫草鱼体内的特异性抗体、中和抗体、6个免疫相关基因的相对表达量及对强毒攻击的保护效果来评价该灭活疫苗的最低免疫保护剂量及免疫效果。结果显示，GCRV-HuNan1307用0.1%的β-丙内酯溶液在4℃环境下对病毒灭活60h效果最佳，该灭活疫苗的最低免疫保护剂量是105.5 TCID50/0.2 mL。所有免疫该灭活疫苗的草鱼都产生了较高的血清抗体滴度和针对GCRV的特异性中和抗体。此外，免疫草鱼的脾和头肾中6个免疫相关的基因表达明显增强，对强毒的攻毒保护率达到80%，保护期可持续一年。该研究成功地研制了II型GCRV灭活疫苗，为草鱼养殖过程中针对GCRV流行强毒株的感染提供有效的候选疫苗制剂。
　　总之，本研究建立了我国草鱼呼肠孤病毒的分子流行病学数据库、明确了GCRV分型分布情况、分析和比较了不同分离株的基因组带型及不同带型分离株的全基因组序列差异，研制了GCRV流行株型的灭活疫苗。本研究不仅为草鱼出血病病原学的深入研究和精准防控产品的开发提供了理论依据，也为草鱼出血病的具体防控储备了候选产品。

目录

声明

英文缩略词

第1章 前言

1.1 草鱼出血病的危害

1.2 草鱼呼肠孤病毒的研究历史

1.3 草鱼出血病的症状及流行规律

1.4 草鱼呼肠孤病毒的生物学和理化特性

1.5 草鱼呼肠孤病毒的细胞培养特性

1.6 草鱼呼肠孤病毒的组织嗜性与致病机理

1.7草鱼呼肠孤病毒的基因组序列与基因分型

1.8 草鱼呼肠孤病毒基因组编码蛋白及其功能

1.9草鱼呼肠孤病毒检测技术

1.10 草鱼出血病的防控

1.11 本研究所要解决的问题

1.12 本研究目的和意义

第2章 草鱼呼肠孤病毒分子流行病学研究

2.1 引言

2.2 材料

2.3 方法

2.4 结果

2.5 小结

第三章 代表株基因组带型和全基因组序列分析

3.1引言

3.2 材料

3.3方法

3.4结果

3.5小结

4.1 引言

4.2材料和方法

4.3结果

4.4 小结

第5章 全文讨论与总结

5.1 关于草鱼呼肠孤病毒分子流行病学

5.2 关于草鱼呼肠孤病毒基因组带型和全基因组序列研究

5.3 关于草鱼呼肠孤病毒流行株灭活疫苗研究

5.4 全文总结

致谢

参考文献

附录：攻读博士期间发表文章和专利