黄花苜蓿冷驯化相关基因MfAIR12和MfWAK的功能鉴定

摘要

黄花苜蓿（Medicago falcata L.）是一种非常抗寒、抗旱及耐贫瘠的豆科牧草，可作为牧草抗逆育种的基因库。本实验室前期做了黄花苜蓿冷响应基因的表达谱，本文选择两个与低温驯化相关的基因（MfAIR12和MfWAK）进行研究，并初步揭示其耐寒机理，主要结果如下：
　　MfAIR12基因研究结果
　　1. MfAIR12（Auxin induced in root cultures）是从黄花苜蓿低温响应表达谱中筛选出的，该基因受生长素诱导，影响根的生长。该基因ORF是693bp，编码231个氨基酸，含有较多的亲水性氨基酸，是一个靠近质膜外侧的跨膜蛋白。序列同源性分析，MfAIR12与其他模式植物的同源性不高，并不是一个进化上保守的蛋白。
　　2.获得了表达 MfWAK基因的转基因烟草。荧光定量 PCR分析表明转基因烟草中MfAIR12有表达，而野生型（WT）中不能检测到。与野生型相比，低温处理后，过表达MfAIR12提高转基因烟草存活率，半致死温度（LT50）降低。转基因烟草积累更多的H2O2，低温处理后，抗氧化酶活性及其基因表达显著提高。
　　3.采用荧光定量PCR检测了转基因烟草及WT中NtDREB1、NtDREB2、NtDREB3、NtDREB4和Cor15a的表达量，结果显示，低温条件下这些基因的表达存在显著差异，转基因烟草中的表达量高于WT，表明MfAIR12参与转基因烟草中系列低温响应基因的表达调控。
　　5.我们还对拟南芥air12突变体及其WT抗冻性进行了比较，在不进行低温驯化或进行驯化处理条件下，air12突变体的LT50均高于野生型，存活率低于野生型。低温处理后，与野生型相比，air12突变体存活率降低，LT50升高，CBF1-3及冷响应基因RD29A、RD29B、Cor15a、KIN1和COR47的表达量显著降低，表明MfAIR12通过提高抗氧化酶活性和上调多个冷响应基因的表达，正调控植物耐寒性。
　　MfWAK基因研究结果
　　1. WAK（wall associated kinase）是细胞壁相关激酶。MfWAK基因是从黄花苜蓿低温响应表达谱里筛选出来的，根据截形苜蓿的同源序列设计引物，从黄花苜蓿中克隆得到一条长2353bp的序列，测序结果表明，该基因是细胞壁相关类受体蛋白激酶（wall-associated receptor protein kinase，WAK）类基因，我们把它命名为MfWAK。MfWAK含有2100bp的开放阅读框，编码699个氨基酸。预测该蛋白的分子量为77.17kDa，等电点为7.1。MfWAK具有EGF结构域，跨膜结构域和保守的胞内激酶结构域，在 N末端含有信号肽序列。系统进化树分析表明 MfWAK与拟南芥AtWAKL14亲缘关系最近，属于第四类WAK/WAKL蛋白家族。
　　2.荧光定量PCR结果显示，正常情况下，MfWAK主要在黄花苜蓿叶柄和根中表达，而在叶、花中未检测到。MfWAK受低温诱导表达，随低温处理时间，表达量呈上升趋势；该基因也受 H2O2，盐和脱水处理诱导表达。MfWAK::GFP融合蛋白定位到细胞膜上。
　　3.构建MfWAK基因过表达载体，获得截形苜蓿的转基因植株。在冷驯化和非冷驯化条件下，过表达MfWAK截形苜蓿半致死温度低于野生型。当低温处理2 h后，过表达植株中CBF1、2、3的表达量显著高于野生型，而CBF4的表达在过表达植株与野生型之间没有差异。低温处理2 h后，转基因植株中CAS15和COR413的表达量显著高于野生型；处理2 h后，转基因植株中LTI65和LTI6A的表达量与野生型差异不显著，处理24 h后，转基因植株中两个基因的表达量显著高于野生型。wak基因缺失突变体存活率降低，LT50升高，植物抗冻性降低。
　　4.转基因拟南芥与野生型相比，存活率高于野生型，而半致死温度低于野生型。转基因拟南芥中CBF基因及其下游COR基因的表达高于野生型。
　　5.过表达 MfWAK提高柱花草最大光化学效率（Fv/Fm），降低其相对电导率，提高转基因柱花草抗冷性。

目录

声明

英 文 缩 略 词

第一章 前言

1.1 低温对植物的影响及冷驯化

1.2 冷信号感知和第二信使

1.3 CBF依赖的信号通路

1.4 类受体蛋白激酶研究进展

1.5 黄花苜蓿耐寒研究概况

1.6 研究目的及意义

第二章 过表达MfAIR12提高转基因烟草耐寒性

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果与分析

2.4 小结与讨论

第三章 过表达MfWAK提高转基因植物耐寒性及抗冷性

3.1 引言

3.2 材料方法

3.3 结果与分析

3.4 小结与讨论

第四章 全文总结

致谢

参考文献

附录A：基因序列

附录B：载体图谱