杜仲细胞培养生产次生代谢物的研究

摘要

杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)单科、单属、单种，是中国特有的名贵经济树种，也是我国传统的珍贵药材，具有补肝肾、强筋骨、降血压、抗衰老、抗肿瘤等功效。千百年来，杜仲皮作为中药在人们医疗保健等方面起着十分重要的作用。其中的绿原酸和桃叶珊瑚苷有广泛的药理作用，具有抗菌消炎、抗癌、抗艾滋病、保肝利胆、抗氧化剂和抑制自由基的功效，具有广阔的药用市场。 杜仲作为国家二级保护植物，在现有资源被充分利用的基础上，也需要得到应有的保护。因此，实现杜仲细胞大规模培养生产绿原酸和桃叶珊瑚苷是保证今后市场需求的手段之一。本论文主要研究了杜仲愈伤组织的诱导及增殖、杜仲细胞悬浮培养体系的建立、绿原酸和桃叶珊瑚苷积累的代谢调控，取得了如下的研究结果： 1．在无菌苗的培育过程中，选用冰箱4-7℃保藏的种子，使用0.1％升汞溶液消毒10 min，平置方式接种的出芽率最高。 2．比较了田间叶片、无菌苗的子叶和真叶等不同外植体，发现无菌苗真叶出愈率最高。在培养基及pH的选择上，选用B5培养基，pH 6.3，诱导愈伤组织效果最好。在2,4-D、NAA、6-BA这三种激素中，最适合诱导愈伤组织的激素是1.0 mg/L2,4-D，NAA的诱导率低于2,4-D，且在后期出现分化现象，而6-BA完全不能诱导出愈伤组织。 3．杜仲愈伤组织的生长曲线大致呈S形，培养周期为15 d，最适继代时间是12～15 d。在50mL三角瓶中，杜仲愈伤组织接种量控制在0.35g鲜重左右比较合适。作为碳源，25g/L蔗糖对愈伤组织的增殖效应最好。最适合继代的培养基为B5培养基，pH为6.3。当2,4-D浓度为0.5 mg/L时，愈伤组织生长最旺盛，增长率最大。在此基础上添加NAA和6-BA，发现NAA的添加降低了愈伤组织的增长率，而6-BA的添加提高了愈伤组织的增长率，最适浓度为0.5 mg/L。 4．杜仲细胞的培养周期为15 d，而桃叶珊瑚苷的含量在第18 d最高。50 g/L鲜重接种量是最适接种量。20 g/L蔗糖作为碳源最合适。最适宜桃叶珊瑚苷积累的悬浮培养基为MS培养基，pH 5.8。最适合桃叶珊瑚苷积累的单个激素是2.0mg/L2,4-D，激素组合是2.0 mg/L2,4-D+0.5 mg/L6-BA。100 mg/L水解酪蛋白最有利于桃叶珊瑚苷的积累，酵母提取物浓度为15 mg/L时，桃叶珊瑚苷的含量最高。 5．绿原酸的含量在第15 d达到最高。35 g/L蔗糖作为碳源最合适。最适宜绿原酸积累的悬浮培养基为MS培养基，pH 5.3。最适合绿原酸积累的激素是1.0mg/L6-BA。400 mg/L水解酪蛋白最有利于桃叶珊瑚苷的积累，酵母提取物浓度为10 mg/L时，桃叶珊瑚苷的含量最高。

目录

文摘

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第一章 绪论

第二章杜仲无菌苗的培育及愈伤组织的诱导

第三章杜仲愈伤组织的继代及增殖

第四章 杜仲细胞悬浮培养生产桃叶珊瑚苷的研究

第五章 杜仲细胞悬浮培养生产绿原酸的研究

结论与展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表论文

致谢