复方丹参注射液治疗RA疗效及其干预CYR61对RA-FLS生物学行为的研究

摘要

目的：旨在研究复方丹参注射液治疗RA的临床疗效和其干预CYR61对于RA-FLS增殖、凋亡和侵袭力的生物学行为影响，旨在获得CYR61直接参与RA-FLS侵袭性的可靠证据及复方丹参注射液的干预机制，为复方丹参注射液治疗RA的应用和确立CYR61作为RA研究和治疗的新靶点提供科学依据。
　　方法：⑴应用随机对照方法观察了212例复方丹参注射液治疗活动期类风湿关节炎20天的临床疗效及安全性；⑵获取RA和正常人滑膜的活组织，然后进行分离和培养，获得纯化的FLS，并应用流式细胞仪对细胞表面标志物进行鉴定；⑶构建CYR61慢病毒载体，然后进行CYR61慢病毒载体的包装和FLS转染。同时应用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术，合成CYR61特异性小干扰RNA（smallinterference RNA，siRNA）瞬时转染RA-FLS。观察以上转染效率和FLS中CYR61表达情况；⑷应用MTS法检测各组FLS增殖率；⑸应用Tunel法检测各组FLS凋亡率；⑹应用Transwell法检测各组 FLS侵袭能力，并应用 ELISA检测各组细胞液中MMP-1,3，10,13水平；⑺应用以上方法观察复方丹参注射液对 RA-FLS中 CYR61基因和蛋白表达以及RA-FLS增殖、凋亡和侵袭力的干预作用。
　　结果：①临床前瞻性研究结果显示，复方丹参注射液治疗组治疗后20天与治疗前比较，触痛关节数、肿胀关节数、晨僵时间、双手握力，患者疼痛程度评估、患者对疾病的总体评估、医生对疾病的总体评估、患者的躯体活动功能（HAQ）、28关节病情活动度评分（DAS28）、血沉（ESR）、C反应蛋白（CRP）和类风湿因子（RF）均有明显改善（P＜0.05）。复方丹参注射液治疗组患者治疗后晨僵时间、双手握力、患者疼痛程度评估、患者对疾病的总体评估、医生对疾病的总体评估、DAS28和HAQ比常规治疗组患者均有明显的改善(P＜0.05）；治疗组患者 ACR20改善率（79.72%）明显高于对照组患者（59.43%）（P＜0.05）；两组患者的不良反应及安全性指标无显著性差异（P＞0.05）。②通过流式细胞仪对3代RA和正常人滑膜细胞表面标记物CD90和CD14表达阳性率检测，发现CD90的阳性率分别为93.43%和96.94%，CD14的阳性率分别是0.22%和0.13%。从检测的结果看滑膜细胞CD90的阳性率接近98%，获得了实验需要的FLS。③FLS转染实验结果显示，两组转染效率都在90%以上。通过Q-PCR和Western blot检测来看，正常人FLS过表达CYR61后，CYR61在FLS中的mRNA和蛋白表达量均明显高于正常人FLS和RA-FLS(P<0.05)；同时，通过CYR61-siRNA干扰RA-FLS后， RA-FLS表达CYR61的mRNA和蛋白非常微量,明显低于其他FLS(P<0.05)，抑制效率达到89.14%。本研究对CYR61的过表达和低表达的转染效率均很高，为下一步的功能研究奠定了基础。④各组FLS增殖情况结果显示，RA-FLS通过转染CYR61-siRNA第5天后，细胞增殖率明显低于正常RA-FLS（P<0.05）；正常FLS转染CYR61过表达载体5天后增殖率比正常FLS明显增加（P<0.05）。结果还显示，第5天的FLS细胞增殖率与细胞CYR61的mRNA和蛋白水平均呈正相关（P<0.01），这说明FLS的增殖与CYR61的mRNA和蛋白表达水平有关。⑤RA-FLS通过转染 CYR61-siRNA后，细胞凋亡率明显高于于RA-FLS和空转染RA-FLS（P<0.05）；正常FLS转染CYR61过表达载体后，细胞凋亡率明显低于其他各组（P<0.05）。FLS细胞凋亡率与细胞CYR61的mRNA和蛋白水平均呈负相关（P<0.01），这说明FLS的凋亡与CYR61的mRNA和蛋白表达水平有关。⑥各组FLS侵袭能力结果显示，RA-FLS侵袭力明显强于正常人FLS（P<0.05）， RA-FLS通过转染 CYR61-siRNA后，细胞侵袭力明显低于其他各组（P<0.05）；正常FLS转染CYR61过表达载体后，细胞侵袭力明显高于其他各组（P<0.05）。结果还显示，FLS细胞侵袭力与细胞CYR61的mRNA和蛋白水平均呈正相关（P<0.01）。同时，应用ELISA对各组细胞液中MMP-1,3，10,13水平进行检测，最后发现，MMP-3与CYR61表达水平和细胞侵袭力相关（P<0.05）。⑦与正常RA-FLS和小剂量复方丹参注射液比较，大剂量复方丹参注射液能抑制RA-FLS增殖和CYR61mRNA和蛋白的表达，促进RA-FLS凋亡，并且具有明显抑制RA-FLS侵袭力（P<0.05）。
　　结论：⑴复方丹参注射液在治疗活动期RA中，具有增效作用，无不良反应。⑵CYR61可能是通过促进RA-FLS增殖、抗凋亡达到滑膜增生，再通过增进RA-FLS表达MMP-3增强其侵袭力达到破坏关节软骨的作用。⑶大剂量复方丹参注射液丹参注射液能抑制RA-FLS增殖和CYR61表达，促进其凋亡，并且抑制 RA-FLS侵袭力，着可能是复方丹参注射液通过这些作用能够起到抑制RA滑膜增生和关节软骨破坏的作用。

目录

声明

引言

第一部分 理论研究

第一章 祖国医学对类风湿关节炎的认识和研究现状

第一节 祖国医学对类风湿关节炎的认识概况

第二节 类风湿关节炎的中医药治疗现状

第三节 “血瘀致痹”的理论依据

第四节 复方丹参注射液治疗类风湿关节炎的理论和基础研究

第一节 类风湿关节炎发病概况及发病机制

第二节 成纤维样滑膜细胞在类风湿关节炎中发病的机制

第三节 高半胱氨酸蛋白61在类风湿关节炎发病中的作用

第三章 研究依据

第二部分 研究内容

第一章 复方丹参注射液治疗活动期类风湿关节炎的临床观察

第一节 资料和方法

第二节 结果

第三节 讨论

第一节 成纤维样滑膜细胞的分离和培养

第二节 成纤维样滑膜细胞的鉴定

第一节 CYR61目的基因的钓取

第二节 CYR61慢病毒表达载体构建

第三节 CYR61慢病毒载体的包装

第四节 CDH-CYR61和CYR61-siRNA转染

第一节 CYR61对RA-FLS增殖和凋亡的影响

第二节 CYR61对RA-FLS侵袭力的影响

第五章 复方丹参注射液对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞CYR61表达及生物学行为的影响

第一节 复方丹参注射液对RA-FLS中CYR61表达的影响

第二节 复方丹参注射液对RA-FLS增殖和凋亡的影响

第三节 复方丹参注射液对RA-FLS侵袭力的影响

第三部分 结 语

1 通过本研究得出的结论

2 本课题的特点与创新之处

3 存在问题与展望

参考文献

在读期间论文、课题和成果

英文缩略词表

致谢