冰冻保存血小板及其制备的血小板凝胶促创面愈合的实验研究

摘要

目的：
　　1.通过体外实验观察冰冻保存剂对混合血小板及其制备的血小板凝胶质量的影响。
　　2.通过动物实验观察冰冻血小板对wistar大鼠急性创面愈合的有效性。
　　方法：
　　1.体外实验研究
　　1.1 冰冻保存剂储存液
　　组方储存液为三种：①纯二甲基亚砜（DMSO），②50×Thrombosol(第二信使调节剂，TS）溶液：阿米洛利12.5mmol/L、腺苷5mmol/L、硝普钠2.5mmol/L溶解于1L纯二甲基亚砜（DMSO）中即为50×TS，③50×(2%DMSO＋1/2TS)溶液：阿米洛利6.25mmol/L、硝普钠1.25mmol/L、腺苷2.5mmol/L溶解于1L纯DMSO中即为50×(2%DMSO＋1/2TS)。
　　1.2 混合富血小板血浆（PooledPlatelet-richplasma，P-PRP）的制备及分组
　　采集健康合格献血者全血400ml，制备单袋PRP，汇集为P-PRP,调整个数使其达到1000×109/L左右。P-PRP留取5ml为新鲜血小板对照组（n=6），然后再分成五等分，制成终浓度为2%DMSO（A组）、5%DMSO（B组）、2%DMSO+TS(C组)、2%DMSO+1/2TS(D组)、及无添加任何保存剂组(E组)为实验组，共六组，放入-80℃冰箱保存。在新鲜血小板保存3天（day,d）及冰冻保存剂组保存1、2、4、8周(week,w)时，37℃水浴复温5分钟（min）。检测血小板计数（PLT）、血小板平均体积（MPV）、PH值、血小板表面活化标志CD62p等，并进行统计学分析。
　　1.3 血小板凝胶（Plateletgel,PG）的制备
　　P-PRP和10%葡萄糖酸钙按照10:1的比例制备血小板凝胶（PG）。检测血小板凝胶上清中生长因子PDGF、VEGF、EGF和TGF-β的含量，并进行统计学分析。
　　2.动物实验研究
　　2.1 PG纱布的制备
　　使用纯DMSO（终浓度2%）冻存P-PRP(计数为1000×109/L左右)后放入-80℃的冰箱保存备用，冰冻两个月后,解冻计数为（680±10）×109/L。P-PRP与10%葡萄糖酸钙按照10:1的比例混合，制备冰冻血小板凝胶纱布（FrozenPG）、新鲜血小板凝胶纱布(FreshPG)。
　　2.2 实验动物造模、分组
　　15只大鼠于脊背两侧做4个直径为1.3cm的全层皮肤缺损。按照随机的原则分别外敷FrozenPG纱布（A组）、FreshPG纱布（B组）、重组人表皮生长因子（rhEGF）纱布（C组）、生理盐水纱布（对照D组），并用无菌3M医用透明敷料固定。于实验的1d、2d、3d、5d、7d、9d、11d更换辅料，测量创面面积，计算创面愈合率，于1d、3d、5d、11d处死大鼠取病理组织标本并行HE及免疫组织化学染色。
　　结果：
　　1.体外实验研究
　　冰冻保存1w时，A、B、C、D、E五组血小板回收率分别为93.1±1.5%、95.7±1%、95±1%，93.8±1.5%，64.2±2%，对照新鲜血小板组保存3d回收率为56±2%，A、B、C、D四组明显优于E组及新鲜对照组（F=8,697,P=0.000）。2及4w时A、B、C、D四组血小板回收率变化不大，8w时明显下降为76±2%，均高于对照组，其中C组略显优势，但四组间无统计学差异（P＞0.05）；MPV及PH值的检测中A、B、C、D四组均优于E组及新鲜对照组（P＜0.05），组间无统计学差异；CD62p表达率检测结果表明，对照组保存3d时,高为78±1.5%，E组为63.2±2%，A、B、C、D四组保存8w时为53.2±2%，明显优于对照组及E组（P＜0.05），四组间无统计学意义。ELISA法检测结果显示，PDGF、VEGF、EGF和TGF-β的含量在保存1w时均优于对照组（P＜0.05）。随着保存时间的延长，四种生长因子含量均有所下降，在保存4w时依然与对照组保存3d时相当，保存8w时略低于对照组。
　　2.动物实验研究
　　各组创面愈合率均随时间的推移逐渐升高。A、B两组创面红润、干净、无渗出物、结痂早、肉芽组织生长丰富、创面触之易出血、愈合后创面平整。伤后早期1d、3d和5d各组之间无统计学意义（P＞0.05），7d时A、B组优于C、D组（P=0.017＜0.05），A、B组间无统计学差异。组织学观察显示A、B两组在血管生成、炎症细胞浸润、细胞排列等方面优于C、D两组，CD31的表达比C、D两组高，CD68的表达比C、D两组出现早，并且表达量高于C、D两组。
　　结论：
　　1.冰冻保存剂保存血小板，2%DMSO及2%DMSO+TS组略显优势，可小剂量保存血小板应用于创伤愈合；PLT、MPV、PH值、CD62p及生长因子的含量在8w之内均优于保存3d时的新鲜血小板。
　　2.冰冻血小板PG在创面愈合方面显示了与新鲜血小板PG同样的促愈合作用，明显优于单一重组人表皮生长因子（rhEGF）。

目录

声明

引言

第一部分 文献研究血小板凝胶及冰冻血小板的研究现状

1 血小板凝胶的研究现状

2血小板凝胶治疗存在问题及解决方案

3 冰冻血小板的研究现状

4 问题与展望

第二部分 实验研究冰冻保存剂对混合血小板及血小板凝胶质量的影响

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果

2.4 讨论

第三部分 动物实验冰冻血小板促大鼠皮肤创面愈合的研究

3.1 材料与方法

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

结语

4.1 对此次研究的整体评价

4.2 研究中存在的问题和展望

参考文献

附录

附 录 1：符号说明

附 录 2：攻读硕士学位其间完成的论文

附 录 3：攻读硕士学位其间参与申报成功的科研项目

致谢