基于16S rRNA基因序列分析红耳龟和四眼斑水龟肠道微生物群落结构

摘要

脊椎动物肠道是一个复杂的生态微环境,其内定植了大量的微生物群落,这些微生物群落对宿主起着包括分解食物、新陈代谢、提供营养,以及提高免疫力和防御病原体入侵等重要作用。动物肠道微生物的研究已成为微生态学最热门的课题。近年,随着测序技术的不断发展和成熟,大量动物的肠道微生物群落结构被认知,但是对于在地球上已拥有2亿多年生活史的龟类动物,还未曾见报道。
　　本研究选取外来物种巴西红耳龟和海南本地物种四眼斑水龟作为研究对象,基于宏基因组方法与454测序技术对肠道细菌群落多样性及其丰度进行研究,为了解龟类动物的肠道微生物的菌群结构,构建红耳龟、四眼斑水龟与肠道细菌群落共生体系和肠道菌群监测平台提供理论基础。
　　本研究分别提取了3只红耳龟和3只四眼斑水龟粪便样品的微生物宏基因组DNA,通过罗氏454高通量技术对样品的16S rRNA基因的V3-V5可变区进行测序,进行细菌多样性的调查。测序结果表明红耳龟和四眼斑水龟具有丰富的肠道微生物多样性。测序共获得163,785条有效序列,在97％的序列相似度下对序列进行归类,共获得1,766个OTUs(Operational Taxonomic Unit;操作分类单位)。根据序列注释结果显示其类群多达16个门,分别为厚壁杆菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、螺旋体门( Spirochaetes)、梭杆菌门( Fusobacteria)、变形菌门( Proteobacteria)、柔膜菌门(Tenericutes)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、互养菌门(Synergistetes)、放线菌门( Actinobacteria)、浮霉菌门( Planctomycetes)、Elusimicrobia、疣微菌门(Verrucomicrobia)、纤维菌门(Fibrobacteres)、黏胶球形菌门(Lentisphaerae)异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)以及一个古细菌广古菌门(Euryarchaeota)。其中厚壁杆菌门和拟杆菌门广泛存在于各样品中,并且占绝对优势。此外,序列注释结果表明肠道中还蕴藏着数量巨大的未知细菌类群,共获未鉴定的序列8,014条,占到总序列的4.89%,而这些菌群序列的获得可为其将来被认知、开发和利用提供重要的基础数据。
　　对于不同物种,肠道菌群体现了宿主特异性。根据 Beta多样性分析,红耳龟和四眼斑水龟表现出较大的差异性,且不同物种种间差异性要远大于种内差异。红耳龟样本共获得71,368条序列和1,061个OTUs,四眼斑水龟获得92,417条序列和705个OTUs,经α多样性分析显示,与四眼斑水龟相比,红耳龟的肠道微生物具有更加丰富的多样性。在类群分类上,红耳龟共获得15个门类,四眼斑水龟获得12个门类,且两组样本在优势菌群的比例上同样表现出差异性,红耳龟肠道的优势菌群为厚壁杆菌门、拟杆菌门和螺旋体门,而四眼斑水龟的肠道优势菌群则更加集中在厚壁杆菌门和拟杆菌门,由此可推测螺旋体门类细菌可能在红耳龟肠道内发挥着某种特殊的作用。而在进一步的菌群种系型分析中,两组样品也存在差异性,例如在分类单位较高的拟杆菌门和互养菌门。而在未知菌种方面,红耳龟也显示出更加丰富的潜在待开发资源,红耳龟共有2,239.67±716.59条未能鉴定的序列,占总比例为9.67±2.34%,而四眼斑水龟未能鉴定的序列数相对较少,仅为431.67±114.29,所占比例为1.43±0.45%。
　　此外,序列注释结果还表明红耳龟和四眼斑水龟肠道内含多种致病菌,包括短螺旋体属(Brevinema)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、志贺菌属(Shigella)和沙门氏菌属(Salmonella)等等。常作为宠物饲养的红耳龟,由于与人类长时间接触,致使这些病原菌很可能构成人畜共患病发生的潜在威胁。而跟据进一步统计结果显示,两组样品的肠道病原菌也存在差异性,主要体现在密螺旋体属(Treponema)、爱德华氏菌属、弯曲菌属(Campylobacter)、短螺旋体属(Brevinema)和克雷伯氏杆菌(Klebsiella),仅有沙门氏菌属和气单胞菌属(Aeromonas)两个属在两组样品中都被发现。因此,全面调查肠道病原菌的种类,对于人畜疾病的病因及预防至关重要。

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1 文献综述

1.1 肠道微生物的研究概况

1.2肠道微生物群落的研究手段

1.3 龟类动物肠道微生物研究进展

1.4本实验研究目的及意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结果与分析

3.1 肠道微生物宏基因组DNA的提取和质量检测

3.2 454测序序列数据统计

3.3 基于OTU（Operation Taxonomic Unit）对样品进行初步分析

3.4 红耳龟和四眼斑水龟肠道微生物多样性分析

3.5 红耳龟和四眼斑水龟肠道菌群结构组成分析

3.6红耳龟和四眼斑水龟的肠道菌群差异性分析

3.7 基于基因型分析红耳龟和四眼斑水龟的肠道病原菌

4 讨论

4.1 16S rRNA基因扩增片段的选取

4.2 Roche 454焦磷酸测序方法

4.3 红耳龟和四眼斑水龟样本肠道微生物群落结构组成

4.4 红耳龟和四眼斑水龟肠道菌群差异性分析

4.5 肠道病原菌的比较分析

5 结论

参考文献

攻读硕士学位期间取得的研究成果

致谢