广南铁皮石斛质量标准及其相关产品开发研究

摘要

目的：
　　铁皮石斛（Dendrobium candidum Wall. ExLindl.)为兰科石斛属多年生附生草本植物的干燥茎，被称为九大仙草之一，是名贵中药材，为国家重点保护中药材。在中国分布于安徽、浙江、云南、福建、贵州、广东、广西、湖南、江西、河南、四川等省，其中尤以广南种铁皮石斛质量佳。本文旨在通过实验，建立广南铁皮石斛质量标准，规范铁皮石斛市场，确保其质量，药效。开发铁皮石斛多糖保水护肤产品，并研究保水机制和评价其安全性。
　　方法：
　　1、广南铁皮石斛质量标准建立
　　通过对铁皮石斛鲜品进行形态鉴定，对其徒手切片及其粉末进行显微鉴定。并采用聚酰胺薄层法对其进行理化鉴别，鉴别其黄酮类成分。多糖成分采用超声提取后分别用紫外分光光度法测定多糖的含量；将各组多糖水解后经HPLC法检测甘露糖的含量。建立一个广东省铁皮石斛质量标准草案。
　　2、铁皮石斛保水护肤品的研究开发
　　2.1、铁皮石斛多糖保水作用有效部位筛选
　　水提醇沉法提取铁皮石斛多糖，采用膜分离法分离得到高分子多糖，中分子多糖，低分子多糖。以生理盐水为空白组，透明质酸为阳性对照组，分别对铁皮石斛总多糖，高分子多糖，中分子多糖和低分子多糖进行动物皮肤水分测试实验。获得有效药用部位并筛选的到最佳用药浓度。
　　2.2、铁皮石斛多糖保水机制研究
　　通过对Hacat细胞体外培养，铁皮石斛多糖刺激细胞，计算多糖刺激后的细胞生长率，获得多糖最佳浓度。培养最佳药物刺激后的细胞，给药后，试剂盒提取细胞总RNA，RT-PCR后，琼脂糖凝胶电泳PCR产物得到水通道蛋白-3和β-actin片段。
　　2.3、铁皮石斛多糖皮肤安全性评价
　　通过整体动物皮肤刺激实验，皮肤光毒性实验，皮肤变态反应实验，对铁皮石斛多糖进行安全性评价。
　　结果：
　　1、广南铁皮石斛质量标准
　　1.1、8个铁皮石斛鲜品的直径仅有1-3mm的区别，8个受测样品的叶鞘均有紫斑，但颜色深浅和斑点多少存在差异。其中浙江省温州种鲜品比其他7种较为粗壮，直径大2-3mm。广东省新丰种和广东省丹霞山种叶鞘紫斑比较明显，颜色较其他6种深，安徽省霍山种叶鞘紫斑最少，青绿色明显。广南铁皮石斛茎的直径在3-7mm之间，茎长15-70cm，节间长1.0-2.5cm，叶鞘多为紫褐色。
　　1.2、8个铁皮石斛横切面显微图无差异。粉末显微鉴别中均有淀粉粒、针晶、晶鞘纤维、薄壁细胞。广南铁皮石斛与其他地区铁皮石斛没有差异。
　　1.3、聚酰胺薄层显示各组铁皮石斛品种中黄酮类成分的种类不同。可用于区别各产地的品种。
　　1.4、8种铁皮石斛多糖含量在10%-35%之间不等。其中4个样本的多糖含量大于25%，产地分别为：广东省新丰、广东省丹霞山、浙江省温州、浙江省义乌。广南铁皮石斛的多糖含量在13%~33%之间。
　　1.5、各组铁皮石斛中甘露糖的含量在15%-25%之间。其中广南铁皮石斛甘露糖含量在17%~24%之间。
　　2、铁皮石斛多糖保水护肤品的研究开发
　　2.1、铁皮石斛多糖保湿皮肤测试筛选最佳保湿药用部位，分别检测铁皮石斛总多糖，高分子多糖，中分子多糖和低分子多糖相比正常组皮肤水分量增加百分比。其中高分子多糖保湿作用最佳，与空白组比较使皮肤保水增加17.5%-37%，且其最佳保湿浓度为0.5%。
　　2.2、铁皮石斛高分子多糖对Hacat细胞体外培养的生存率的影响，含0.5μg/mL铁皮石斛高分子多糖能促进Hacat细胞生长，给药刺激24h后，使细胞生长率与正常组比较提高54%，且P<0.05，有统计学意义。提取铁皮石斛高分子多糖刺激后6h的Hacat细胞总 RNA，RT-PCR，在内参β-actin相同的条件下，铁皮石斛高分子多糖组比空白组和阳性对照组水通道蛋白-3表达均上调，阳性对照组也相对于空白组有所上调。
　　2.3、对铁皮石斛高分子多糖进行安全性评价，通过皮肤刺激实验，皮肤光毒性实验和皮肤变态反应实验证明铁皮石斛高分子多糖对皮肤无刺激。
　　结论：
　　广南铁皮石斛茎的直径在3-7mm之间，茎长15-70cm，节间长1.0-2.5cm，叶鞘多为紫褐色。广南铁皮石斛样本与其他产区样本显微镜下结构、细胞及内含物无差异。广南铁皮石斛各品种间黄酮类成分也并不相同，但可以用于鉴别广南铁皮石斛不同产地。其中丹霞山的黄酮类成分含量最多，并且种类也较多。其他产区中广东省翁源，广东省新丰和浙江省义乌产区的铁皮石斛黄酮类较少。广东省潮州和云南省文山的黄酮类的种类和含量均相似。建议拟定合格的广南铁皮石斛多糖的含量应大于20%，甘露糖含量在17%~24%之间。
　　铁皮石斛多糖的确具有保湿作用，筛选得到的高分子多糖就有较好的保湿作用，比目前市面上公认的透明质酸的保湿作用都明显。通过分子生物学技术对铁皮石斛高分子多糖保湿机制研究得到多糖可能是通过调节皮肤中水通道蛋白-3的表达从而达到保水的作用。并且不引起皮肤刺激，无光毒性及无过敏反应。说明铁皮石斛多糖保水护肤的作用明显，机制明确，且安全无毒副作用。

目录

声明

引言

第一章 研究背景及立题依据

1.1 铁皮石斛研究进展

1.2 铁皮石斛在化妆品中的应用

1.3 水通道蛋白-3研究进展

1.4 药物安全性评价

1.5 立题依据与研究意义

第二章 广南铁皮石斛质量标准的建立

2.1 材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

第三章 铁皮石斛保水护肤品的开发

3.1 材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

第四章 结语和展望

4.1 结语

4.2 展望

参考文献

附录

附 录 1：实验显微图

附 录 2：硕士研究生在读期间发表的论文

附 录 3：实验动物伦理表

致谢