重症中暑肝窦内皮细胞损伤的初步研究

摘要

目的: 1.观察重症中暑大鼠肝损伤变化规律。 2.探讨肝窦内皮细胞(SEC)在重症中暑大鼠肝损伤过程中结构及功能损伤的表现。 3.探讨血必净预处理后，肝脏及肝窦内皮细胞(SEC)在组织学损伤、炎症损伤、微循环障碍等方面的变化。 方法: 1.建立重症中暑大鼠模型，按不同中心体温组采集标本。 成年SPF级雄性Wista大鼠共36只，体重约250-350g之间，将其随机分为6组，:A.室温对照组（Sham组）6只，于实验开始后第90分钟时处死并采集标本;B.中心体温39℃组6只，造模过程中大鼠中心体温达到39℃时立即将其处死并收集标本;C.中心体温42℃组6只，造模过程中大鼠中心体温达到42℃时立即将其处死并收集标本;D.重症中暑组(HS组)6只，大鼠造模成功后立即将其处死并收集标本;E.血必净预处理重症中暑组（XBJ组）6只，造模前48小时尾静脉注射血必净注射液预处理，大鼠造模成功后立即将其处死并收集标本;F.生理盐水预处理+重症中暑组(XBJ组)6只，下文简称为saline组，造模前48小时尾静脉注射与血必净注射液同等剂量的生理盐水预处理，大鼠造模成功后立即将其处死并收集标本。 2.动态观察观察重症中暑形成过程中梯度热打击处理后大鼠肝酶谱及肝脏病理损伤情况、超微结构变化及细胞凋亡变化。 2.1检测大鼠血清中谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)浓度。 2.2 HE染色后光镜下观察各组大鼠肝脏组织学变化。 2.3 TUNNEL方法检测各组肝脏细胞凋亡情况。 3.动态观察各组SEC损伤规律，包括各组大鼠循环血中SCE损伤标记物的浓度以及血管舒缩物质的浓度变化、SEC超微结构的变化、相关因子的表达变化。 3.1检测各组大鼠血清中SEC损伤标志物的浓度，包括血栓调节蛋白(TM)、透明质酸(HA)、(vWF); 3.2透射电镜下观察各组SEC的超微结构变化。 3.3免疫组化方法检测各组大鼠肝脏中SEC表达vWF、组织因子(TF)、TM的变化。 3.4 PCR方法检测各组SEC表达粘附分子(ICAM-1)、白介素-6(IL-6)、TF的变化。 3.6检测大鼠循环血中内皮素-1（ET-1）及一氧化氮(NO)浓度的变化。 结果: 1.热打击中暑大鼠从42℃组开始出现明显肝损伤，且其程度随温度梯度增高而增加，以HS组及saline组为明显。 1.1中暑大鼠血清AST、ALT浓度HS组与saline组较对照组明显增高，42℃组次之(P＜0.05)，XBJ组较中暑组低(P＜0.05); 1.2中暑致肝脏病理结构损害从大鼠中心体温达42℃时开始，HS组及saline组明显，其病理损害以肝窦周边表现明显，XBJ组损害不明显。 1.3中暑致肝细胞凋亡从大鼠中心体温达42℃时开始明显增加，HS组及saline组为著(P＜0.05)，且凋亡细胞主要集中于肝窦周边，XBJ组损害不明显。 2.中暑致SEC结构及功能损伤 2.1中暑致SEC血清标志物浓度变化: 2.1.1中暑致sTM浓度降低:39℃组较SHAM组增高，但42℃组、HS组以及saline组均显著降低，以HS组为明显，而XBJ组较中暑组高(p＜0.05); 2.1.2中暑致HA浓度增高:42℃组、HS组与saline组较对照组高，XBJ组则次之，数据差异明显(p＜0.05); 2.2.3中暑致vWF浓度增高:血清vWF浓度在39℃组即开始缓慢升高，以42℃组、HS组以及saline组为明显，HS组较42℃组增高明显，XBJ组较HS组低(p＜0.05); 2.2.4中暑致SEC表达血管舒缩物质浓度失衡:ET-1浓度从39℃组开始逐渐增高，HS组及saline组增高显著，XBJ组较42℃组高，但低于HS组(p＜0.05);而SHAM组与39℃组NO浓度无明显差异(P＜0.05)，42℃组浓度下降明显，HS组与saline组浓度下降显著，XBJ组较42℃及HS组高(P＜0.05); 2.2中暑致SEC超微结构变化:对照组及39℃未见明显超微结构变化;42℃组:SEC出现明显肿胀，细胞完整结构结构破坏明显，局部见空泡样变性，内质网肿胀且模糊不清，肝窦扩张，淤血明显，局部有灶性出血病灶;HS组与saline组:SEC明显缩小，细胞核皱缩变形，肝窦扩张，淤血加重;XBJ组:SEC结构完整，局部空泡样变性，淤血较前减轻。 2.3中暑致内皮相关标志物免疫组化表达结果:SHAM组及39℃组均未见明显TF及vWF表达，42℃、HS组以及saline组肝窦周边TF及vWF表达明显，而XBJ组表达明显减少，COD值进行分析显示数据差异明显(P＜0.05);42℃组、HS组及saline组肝窦周边TM表达显著减少明显，XBJ组有轻度表达，各组免疫组化COD值进行分析结果显示:差异明显(P＜0.05); 3.中暑致肝组织IL-6、ICAM-1、TFmRNA表达变化:HS组TF mRNA明显增高，ICAM-1及IL-6的mRNA在42℃组及HS组表达增加明显，数据差异具有显著性(P＜0.05) 结论: 梯度热应激过程中出现明显肝损伤，肝窦区域局部微循环障碍;重症中暑梯度热打击过程中SEC出现明显结构破坏及功能损伤，并通过表达TM、TF、vWF等凝血相关因子，以及表达ET-1与NO等血管舒缩物质的浓度失衡而导致局部微循环紊乱，进而加剧肝损伤可能;血必净预处理可减轻中暑大鼠的SEC结构及功能损伤，并通过调节相关凝血因子的表达而减轻肝微循环障碍。

目录

声明

摘要

前言

第一章 文献综述

1．1 中医药防治中暑的研究

1．2 血管内皮细胞在重症中暑中的作用研究现状

1．3 SEC与肝损伤

1．4 小结

第二章 实验研究

2．1 实验材料

2．1．1 主要实验仪器

2．1．2 主要试剂与耗材

2．2 实验方法

2．2．1 建立中暑大鼠模型

2．2．2 标本采集

2．2．3 ELISA方法检测血清标志物

2．2．4 肝脏组织切片及HE染色检测

2．2．5 透射电镜检查

2．2．6 免疫组化染色

2．2．7 TUNEL染色步骤

2．2．8 肝组织IL-6、ICAM-1、TFmRNA表达RT-PCR步骤

2．3 结果

2．3．1 各组中暑大鼠肝损伤比较

2．3．2 梯度热打击下SEC结构及功能变化

2．4 讨论

2．4．1 梯度热打击致肝损伤

2．4．2 梯度热打击致SEC损伤及其参与介导的局部微循环紊乱

结语

参考文献

附录

研究生在学期间发表论文情况

致谢