广藿香醇抗幽门螺杆菌相关性胃炎机理研究

摘要

目的: 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）是最常见的传染性病原菌之一，全球有超过50％的人群感染。Hpylori感染不但是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因，而且与胃黏膜相关性淋巴瘤及胃腺癌的发生密切相关。世界卫生组织已将H.pylori列为第一类致癌因子。抗生素为目前治疗H pylori感染的主要药物，但随其广泛应用，H.pylori耐药问题及胃肠道菌群失调不良反应日趋严重。因此，研发新一代安全、高效、高选择性的抗H pylori药物具有重要意义。 在对南药广藿香的研究中发现:(1)主要成分广藿香醇能显著抑制小鼠H.pylori感染胃炎的炎症反应，减少H.pylori载荷量;(2)高选择性抑制H.pylori及其特异代谢酶——脲酶，而不影响肠道正常菌群的生长。脲酶不仅是H.pylori区别于其它胃肠道微生物的主要特征，而且是H.pylori在胃部生存的关键酶，对其致病起决定作用。本研究以脲酶为切入点，应用酶学方法研究广藿香醇抑制H.pylori脲酶的机理，并通过H.pylori脲酶体外诱导胃黏膜上皮细胞GES-1损伤模型和急性胃溃疡动物模型的建立，探讨广藿香醇治疗H pylori相关性胃炎的机理。 方法: 1.广藿香醇对H.pylori脲酶和洋刀豆脲酶活性抑制作用研究 以H.pylori脲酶和洋刀豆(Jack bean)脲酶为研究载体，通过脲酶活性抑制试验、抑制类型分析、动力学研究、抑制位点分析、分子对接研究，探讨广藿香醇特异性抗H.pylori及其脲酶的机理。 2.广藿香醇对H.pylori脲酶诱导胃上皮细胞GES-1损伤的保护作用 通过H.pylori脲酶体外诱导GES-1细胞损伤模型的建立，模拟H.pylori侵染胃黏膜特征，考察广藿香醇对脲酶致GES-1损伤的影响;进行相关炎症介质，氧化水平及凋亡分析，从炎症、氧化应激及细胞凋亡角度阐述广藿香醇治疗H.pylori相关性胃炎的作用机理。 3.广藿香醇对急性胃黏膜损伤的保护作用研究 分别采用无水乙醇，吲哚美辛，幽门结扎及水浸应激四种诱导方法，建立大鼠急性胃溃疡模型，考察对溃疡面积和溃疡指数的影响，分析相关模型炎性介质，氧化水平，胃黏膜血流量(GMBF)和胃黏液量，评价广藿香醇对胃黏膜的保护作用及机理。 结果: 1.广藿香醇对H.pylori脲酶和洋刀豆脲酶活性抑制作用研究 (1)对脲酶活性抑制作用研究 结果显示，广藿香醇抑制H.pylori和Jack bean脲酶的半数抑制浓度(IC50)分别为2.67±0.798 mM和2.993±0.411 mM，阳性对照乙酰氧肟酸(AHA)抑制H.pylori和Jack bean脲酶的IC50分别为0.585±0.242mM和0.379±0.256mM。抑制作用虽不及AHA，但半数抑制浓度仍达至毫摩尔级别。 (2)抑制类型分析 H.pylori和Jack bean脲酶酶促反应米氏常数KM分别为1.47±0.12 mM和11.12±0.12 mM，最大反应速度vmax分别为0.85±0.11 mM/min和0.50±0.11mM/min。通过Lineweaver-Burk双倒数作图法，得到广藿香醇抑制Hpylori脲酶的动力学参数的变化特点:KM不变，vmax降低，属非竞争性抑制类型;Jack bean脲酶KM减少，vmax降低，属反竞争性抑制。 (3)动力学研究 根据广藿香醇与脲酶的反应进度曲线，反应速率常数vo，vs和kapp分别为1.6×10-1mM/min，1.6×10-2 mM/min和1.1 min-1，脲酶反应过程中呈现浓度依赖性。 (4)抑制位点分析 广藿香醇对脲酶的作用位点可能是巯基，同时对Ni2+亦有一定影响;对H.pylori和Jack bean脲酶的抑制作用具有不可逆性，加入DTT不可恢复两者活性。 (5)分子对接研究 分子对接研究显示，广藿香醇作用H.pylori脲酶活性中心，通过羟基螯合活性腔底部Ni2+，并以氢键结合活性中心关键氨基酸残基，影响脲酶活性构象。广藿香醇对H pylori脲酶亲和力优于Jack bean脲酶，与上述抑酶作用及位点分析较为一致。 2.广藿香醇对H.pylori脲酶诱导胃上皮细胞GES-1损伤的保护作用 MTT和LDH试验显示，广藿香醇(5，10，20μM)对H.pylori脲酶致GES-1细胞存活率下降具有抑制作用;有效降低H.pylori脲酶诱导GES-1致炎因子释放（IL-2，IL-4，NO和TNF-α），提高抗炎因子水平(IL-13)，从而减轻炎症损伤。AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞术结果显示，广藿香醇能有效抑制H.pylori脲酶致GES-1细胞凋亡;与Hoechst染色结果一致，广藿香醇干预后可减少核固缩与碎裂、凋亡小体出现;抑制脲酶致GES-1线粒体膜电位MMP下降，降低ROS产生;显著提高SOD和CAT活性，降低MDA含量。上述结果提示，广藿香醇对H.pylori脲酶所致GES-1损伤的保护作用可能与降低细胞炎症水平，减轻氧化损伤及抑制凋亡有关。 3.广藿香醇对急性胃黏膜损伤的保护作用研究 广藿香醇(10，20和40 mg/kg)口服给药能有效对抗无水乙醇及吲哚美辛所致大鼠胃黏膜损伤，降低溃疡面积和溃疡指数，改善病理形态及炎症性反应;降低无水乙醇致胃黏膜损伤大鼠血清TNF-α和IL-6含量，提高IL-10水平;提高胃黏膜损伤大鼠胃组织CAT和GSH水平，降低MDA含量;提高胃溃疡大鼠胃组织中NP-SH和PGE2含量;上调吲哚美辛致胃溃疡大鼠胃组织COX-1和COX-2的mRNA表达;提高应激性溃疡大鼠GMBF，改善胃黏膜损伤;提高幽门结扎大鼠胃黏液含量。由此，广藿香醇胃黏膜保护作用可能与改善炎症反应，调节氧化系统平衡，提高PGE2水平和胃黏液含量，改善GMBF，增加胃黏膜防御功能有关。 结论: 1.广藿香醇对菌源性和植物源性脲酶的抑制作用较相似，然而其抑制方式存在一定差异;广藿香醇对H.pylori脲酶亲和性高于Jack bean脲酶，可能与其特异性抗H pylori有关，初步推断广藿香醇抑制脲酶的位点为活性中心及其附近氨基酸残基。 2.建立H.pylori脲酶感染人胃上皮GES-1细胞模型，验证了广藿香醇对H.pylori脲酶所致GES-1损伤的保护作用;机制可能与降低细胞炎症反应，减轻氧化损伤及抑制凋亡有关。 3.验证广藿香醇对急性胃溃疡的保护作用，揭示其机制可能与改善炎症反应，调节氧化系统平衡，提高PGE2水平和胃黏液含量，改善GMBF，增加胃黏膜防御功能有关。体内外胃黏膜保护作用均与炎症、氧化应激相关。 综上，广藿香醇治疗H.pylori相关性胃炎的机制可能包括:(1)抑制脲酶活性，减少H.pylori在体内的定植及造成的胃黏膜损伤;(2)改善炎症反应，减轻氧化损伤，增加胃黏膜防御功能。研究成果有助阐明广藿香治疗消化系统疾患的药效物质及作用机理，为新型脲酶抑制剂及抗H.pylori相关性胃炎药物研发提供基源于中药的一类新的先导化合物。

目录

声明

摘要

引言

第一部分 文献研究

第一章 幽门螺杆菌研究进展

1 概述

2 H.pylori感染与胃肠道疾病

3 H.pylori感染的药物治疗

4 H.pylori致病机理的研究进展

第二章 脲酶的研究进展

1 概述

2 脲酶的结构特征

3 主要的脲酶抑制剂及其抑制机理

4 分子对接在脲酶研究中的应用

第三章 胃黏膜保护作用研究进展

1 概述

2 胃粘膜保护作用研究方法

3 胃粘膜损伤与氧化应激

4 胃黏膜损伤与炎症

5 胃黏膜血流量

第四章 广藿香和广藿香醇的研究进展

1 概述

2 广藿香的化学成分

3 广藿香的药理作用研究

4 广藿香醇的研究概况

第二部分 实验研究

第一章 广藿香醇对H.pylori脲酶和洋刀豆脲酶活性抑制作用研究

第一节 广藿香醇抑制脲酶活性作用研究

第二节 广藿香醇抑制脲酶动力学研究

第三节 广藿香醇对脲酶抑制位点研究

第四节 广藿香醇与脲酶活性中心分子对接研究

第二章 广藿香醇对H.pylori脲酶诱导胃上皮细胞GES-1损伤的保护作用

第一节 广藿香醇对H.pylori脲酶诱导胃上皮细胞GES-1凋亡研究

第二节 广藿香醇对H.pylori脲酶诱导胃上皮细胞GES-1机理研究

第三章 广藿香醇对急性胃黏膜损伤的保护作用研究

第一节 广藿香醇对无水乙醇致大鼠急性胃黏膜损伤的保护作用

第二节 广藿香醇对吲哚美辛致大鼠急性胃黏膜损伤的保护作用

第三节 广藿香醇对大鼠水浸束缚应激后胃黏膜血流量的影响

第四节 广藿香醇对胃液分泌的影响

结语

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢