绝经后骨质疏松症及补肾方治疗后全基因组微小RNA表达谱研究

摘要

绝经后骨质疏松症(Postmenopausal osteoporosis，PMOP)是一种发生于绝经后妇女的全身性骨代谢疾病，以骨脆易于发生骨折为特点。随着人类寿命的延长，妇女绝经后仍然有数十年的生命过程，但骨质疏松症当前已是中老年女性退行性疾病中一常见病、多发病，严重威胁其生存质量、身心健康。因此，预防和治疗绝经后骨质疏松是需要共同面对的健康问题。
　　补肾方是中医临床对肾虚型绝经后骨质疏松症主要的、常用的、有效的治疗方法，广州中医药大学第三附属医院院内制剂骨康方是治疗PMOP的验方，温补肾阳、强筋壮骨、益气健脾、活血通络;中医传统经方六味地黄丸和金匮肾气丸分别是偏补肾阴虚和肾阳虚的的常用方和基础方，但这些补肾方的分子机制和靶点治疗尚不清楚，有待阐明。
　　微小RNA(microRNA, miRNA)是一些短小的非编码RNAs，能介导基因的转录后沉默，与细胞增殖分化迁移、疾病的发生和进展都有关系，骨组织的生长、代谢同样与miRNA密切相关。与骨代谢相关的miRNA表达水平变化会引起骨质代谢异常，导致骨质疏松等骨病的发生。miRNA广泛存在于人体体液中，因此，通过检测循环中miRNA的变化，可为疾病的诊断和治疗提供潜在的可能性。
　　本研究应用高通量测序技术，对比正常和绝经后骨质疏松的动物模型血浆中miRNA的表达情况，对比PMOP模型与经补肾方灌胃治疗后的动物模型血浆中miRNA的表达变化，判断miRNA在PMOP发病机制及补肾方治疗中的作用;并对差异显著的miRNA进行生物信息学分析，为以其为靶点的基因治疗提供理论和实验基础。本研究将为绝经后骨质疏松症提供一个新的有潜力的预防诊断标记、预后标记和治疗靶点。
　　目的:
　　1.检测绝经后骨质疏松症动物模型与正常对照组血浆全基因表达谱，筛选差异表达的miRNAs，从中寻找起关键调控作用的差异表达的miRNAs，推测能够作为疾病生物标志物的miRNAs，为PMOP的病机研究和诊断提供理论依据。
　　2.检测PMOP与三种补肾方治疗后PMOP动物血浆全基因表达谱，分别筛选差异表达的miRNAs，探讨补肾方治疗PMOP的可能机制及三种补肾方治疗机制的异同。
　　3.对差异表达显著的miRNA进行生物信息学分析，明确miRNA表达水平的变化可能是骨质疏松发生的重要通路;探讨miRNA参与补肾方治疗PMOP的可能作用途径靶点。
　　方法:
　　1.将六月龄体质量180-220g的SD大鼠随机分为假手术(SHAM)和卵巢切除术(OVX)两组。SPF级实验室适应性喂养一周后，OVX组经背部切除双侧卵巢，SHAM组在卵巢附近切除等量脂肪组织。术后12周经骨密度检测等统计分析确定绝经后骨质疏松症动物模型建立成功。
　　2.将PMOP模型组大鼠随机分为PMOP模型组（PMOP组）、骨康方治疗组(PMOP+GK组)、六味地黄丸治疗组（PMOP+LW组）及金匮肾气丸治疗组（PMOP+JG组）。三组补肾方治疗组分别给予骨康方煎剂、六味地黄煎剂、金匮肾气丸煎剂按照中剂量生药4.8g/kg、12.6g/kg、12.6g/kg大鼠体质量灌胃，每天一次; SHAM组和PMOP组给予等量的生理盐水灌胃，每天一次。持续灌胃12周后，骨密度检测确定补肾方治疗有效，对各组大鼠进行腹主动脉采血，分离血浆备用。
　　3.TRIzol LS试剂提取各组血浆样本总RNA，总RNA在T4RNA连接酶的作用下加上3'、5'small RNA测序接头，所得产物经RT-PCR扩增以及聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化生成small RNAs文库，并进行文库质量分析，使用Illumina cBot簇生成系统进行测序文库的克隆扩增，应用Illumina高通量测序仪对SHAM组、PMOP组、PMOP+GK组、PMOP+LW组和PMOP+JG组SD大鼠血浆样本中的miRNA进行全基因组表达谱检测，原始数据处理后分别比较其miRNA表达的差异。
　　4.运用三个目前最主要的miRNA靶基因数据库:TargenScan、mirbase和miRanda对差异显著的miRNAs进行靶基因分析，筛选出数据库重叠的miRNA靶基因作为最终miRNA靶基因;基于GO数据库对miRNAs进行功能分类，将其归类至相应的生物过程、分子功能和细胞组分中;从GO注释中追踪KEGG信号通路的信息，继续富集这些表达差异显著的miRNAs至对应的信号通路。
　　成果:
　　1.PMOP组样本与SHAM组对照样本之间差异表达的miRNA共829种，在PMOP组呈表达上调的有383种，其中17种显著上调，差异比值最大的miRNA为rno-miR-206-3p（比值4.5）;呈表达下调的有446种，其中37种显著下调，差异比值最低的miRNA为rno-miR-152-3p（比值0.2）。
　　2.PMOP+GK组与PMOP组对照样本之间差异表达的miRNA共617种，在PMOP+GK组呈表达上调的有192种，其中41种显著上调，差异比值最大的miRNA为rno-let-7i-5p（比值22.1）;呈表达下调的有425种，其中31种显著下调，差异比值最低的miRNA为rno-miR-206-3p（比值0.02）。
　　3.PMOP+LW组与PMOP组对照样本之间差异表达的miRNA共606种，在PMOP+LW组呈表达上调的有102种，其中2种显著上调，差异比值最大的miRNA为rno-miR-novel-chr6_36168（比值3.6）;呈表达下调的有504种，其中47种显著下调，差异比值最低的miRNA为rno-miR-novel-chr14_8300（比值0.04）。
　　4.PMOP+JG组与PMOP组对照样本之间差异表达的miRNA共619种，在PMOP+JG组呈表达上调的有191种，其中64种显著上调，差异比值最大的miRNA为rno-miR-144-5p（比值35.9）;呈表达下调的有428种，其中34种显著下调，差异比值最低的miRNA为rno-miR-122-5p（比值0.005）。
　　5.靶基因分析:筛选出三种补肾方共同差异表达的miRNAs，即三个补肾方同时下调的5个miRNAs:rno-miR-100-5p、rno-miR-novel-chr14_8432、rno-miR-novel-chr14_8912、rno-miR-novel-chr14_9053、rno-miR-novel-chr1_19071，与SHAM组相比他们在PMOP组都显著上调。五个miRNAs的靶基因做整合分析，发现交联最多的靶基因有:Panx2、RGD1561161、Grin1、Plekhg5、Elk4、 Cx3cl1、 RGD1311447、Tnfrsf2、Socs1、Mmp9、Ctxn1、Dixdc1、Dbt、Sgsm2、Pbx2; rno-miR-100-5p的靶基因有157个，其中筛选出Mtmr3、Acer1、Shank2。
　　6.信号通路分析:这些靶基因涉及骨代谢的多个细胞通路，根据富集得分，其中与骨代谢密切相关的三条通路:MAPK信号通路、Wnt信号通路和破骨细胞分化通路，对应其详细靶基因信息，找到5个miRNAs中与其密切相关的靶基因:MAPK信号通路中的基因Elk4和破骨细胞分化通路中的基因Socs1。
　　结论:
　　1、绝经后骨质疏松症大鼠血浆与正常血浆相比伴有一系列miRNA表达水平的改变，经GO功能分析和Pathway分析，miRNA表达水平的变化可能是引发PMOP的重要通路。
　　2、补肾方可能通过下调PMOP大鼠血浆中miR-100-5p或四个新的miRNA(miR-novel-chr14_8432、miR-novel-chr14_8912、rno-miR-novel-chr14_9053、rno-miR-novel-chr1_19071)的表达水平，刺激其调控MAPK信号通路中的基因Elk4和破骨细胞分化通路中的基因Socs1的表达，从而起到抗骨质疏松的作用。

目录

声明

摘要

引言

第一部分 文献研究

1．1 中医药与绝经后骨质疏松症研究进展

1．1．1 病因病机研究

1．1．2 辩证论治研究

1．1．3 补肾方应用研究

1．1．4 中医药研究中存在的问题

1．2 现代医学与绝经后骨质疏松症研究进展

1．2．1 病因病机研究

1．2．2 现代治疗研究

1．2．3 研究中存在的问题

1．3 miRNA与绝经后骨质疏松症的研究进展

1．3．1 miRNA的产生与作用机制

1．3．2 miRNA的生物学功能研究

1．3．3 miRNA的研究技术方法

1．3．4 miRNA在绝经后骨质疏松症研究中的应用

1．4 小结

第二部分 实验研究

2．1 绝经后骨质疏松症及补肾方干预后血浆miRNA表达谱研究

2．1．1 材料与方法

2．1．2 结果

2．1．3 讨论

2．2 差异表达miRNA生物信息学分析

2．2．1 材料与方法

2．2．2 结果

2．2．3 讨论

结语

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢