穿心莲同源四倍体诱导、鉴别及有效成分含量测定研究

摘要

目的:
　　穿心莲来源于爵床科植物穿心莲Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees.，别名一见喜、斩蛇草、苦草、橄榄莲，为广东道地药材，以地上部分入药。味苦，性寒。具有清热、解毒，凉血、消肿的功效，用于感冒发热、咽喉肿痛，口舌生疮，顿咳劳嗽，泄泻痢疾，热淋涩痛，痈肿疮疡，蛇虫咬伤。主要化学成分为穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯等。
　　我国穿心莲野生资源极其罕见，商品药材99％以上来源于栽培种，但由于各地的地理环境、水土、气候及生产管理等情况不同及长期人工栽培缺乏系统科学的管理，造成穿心莲品种退化、产量下降、有效成分含量不稳定等现象严重，穿心莲药材质量参差不齐。开展高产优质、药用成分含量高新种质的培育研究迫在眉睫，也是市场的迫切需求。药用植物四倍体，为自然界普遍存在的现象，与二倍体比较，在形态上表现为根粗大、茎粗壮、叶片增大、颜色浓绿等营养器官的巨型性;在生理上则对病虫害和不良环境有较强的抗逆性;生物量上表现为较快的新陈代谢，如同化物质，糖分、蛋白质、氨基酸、维生素等含量的增高。药用植物的多倍化是获得优良种质重要途径之一。
　　本研究采用染色体倍性育种技术，诱导产生穿心莲同源四倍体植株并对其进行染色体倍性鉴别，比较同源四倍体与二倍体植株单株重、有效成分穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量的差异，为选育产量高、有效成份含量高、品质优良的穿心莲新种质提供技术支持，为穿心莲种质资源的可持续利用及穿心莲规范化种植的产业化推广提供理论依据和技术基础。
　　方法:
　　(1)采用单因素法考察0.2％升汞消毒时间(1、3、5、7、9 min)、成熟状态（未成熟的、完全成熟的）、贮藏时期（贮藏半年、贮藏一年）、培养基(纯琼脂、1/2 MS、MS、MS+2 mg/L6-BA)、预处理方式（0.5％硝酸钾浸泡2h、0.1 mol/L水杨酸浸泡2h、30％双氧水浸泡2h、40％硫酸浸泡2h、空白对照）、光照条件（光照条件、黑暗条件）对穿心莲种子萌发率的影响;考察生长调节剂(6-BA、KT、NAA)、小叶榕气生根提取物浓度(0、20、40、60、80、100％)对穿心莲组织鲜重增长率的影响。
　　(2)采用单因素法考察实验材料（茎尖、茎段、根部）、化学诱导方法（浸泡法、琼脂法）对穿心莲同源四倍体诱导效果的影响，筛选出合适的材料和方法。
　　(3)采用L16(44)正交设计法考察秋水仙素浓度(0、200、400、600、800、1000mg/L)、处理时间(7、14、21、28 d)、DMSO浓度(0、10、20、40 g/L)、激动素浓度(0、0.1、0.2、0.4 mg/L)对穿心莲同源四倍体诱导效果的影响，筛选出合适的诱导剂浓度和处理时间。
　　(4)采用形态学、细胞学及染色体计数法对穿心莲二倍体、同源四倍体植株的形态指标（株高、茎粗、叶片长宽与面积、果实长和种子直径），下表皮特征（气孔长宽、气孔密度、叶绿体数目）及根尖染色体数目进行测定。
　　(5)采用重量法测定穿心莲同源四倍植株单株重，采用高效液法测定不同倍性穿心莲植株有效成分穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量，明确穿心莲染色体不同倍性类型与药材产量及穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量的相关性。
　　结果:
　　(1)采用采收半年的穿心莲完全成熟种子，用40％硫酸浸泡2h的预处理，0.2％升汞消毒时间5 min，接种入1/2 MS基本培养基，光照条件，有利于穿心莲种子的萌发。KT浓度为1.0 mg/L，NAA浓度为0.05 mg/L，穿心莲组织鲜重增长率为1000％，达到最大值。添加20％的小叶榕气生根提取物对穿心莲组织鲜重增长率的影响最大，达到737％。
　　(2)自然条件下，2000mg/L的秋水仙素直接点滴穿心莲幼苗生长点，处理6次，形态变异率、同源四倍体变异株数、加倍率均显著增高，诱导率为8.7％。组培条件下，以穿心莲的茎段（带茎节）作为处理材料，诱导率可达到12.5％。
　　(3)采用琼脂法，以MS+10 mg/L KT+0.01 mg/L NAA为培养基，添加200mg/L秋水仙素、10 mg/L DMSO、0 mg/L KT、处理28 d，穿心莲同源四倍体的诱导率可达到20％。
　　(4)经形态学鉴定，穿心莲同源四倍体植株的株高显著矮于二倍体，茎粗、叶片长度、叶片宽度、叶片面积、果实长度、种子直径极显著大于二倍体，同源四倍体具有植株矮小、茎粗、叶片厚、叶面积大、果实长、种子大等特征，且叶片颜色较二倍体浓绿。经细胞学鉴定，同源四倍体的叶片下表皮细胞气孔长度、宽度、密度、叶绿体数分别是二倍体的130％、107％、56％、200％。经染色体鉴定，所得同源四倍体数(约100)是二倍体染色体数目(约50)的2倍，可以确定所得植株为穿心莲同源四倍体植株。
　　(5)采用重量法测得穿心莲同源四倍体单株重(3.71 g)是二倍体(1.30 g)的285％;采用高效液相法测得穿心莲同源四倍体的叶、茎穿心莲内脂含量（分别为0.726 mg/g、0.520 mg/g）比二倍体（分别为0.711 mg/g、0.422mg/g）高;穿心莲同源四倍体的茎脱水穿心莲内脂含量(0.130 mg/g)比二倍体（0.079 mg/g）高，而同源四倍体的叶脱水穿心莲内脂含量（0.096 mg/g）比二倍体（0.134 mg/g）低。
　　结论:
　　本研究开展了穿心莲种子无菌萌发及增殖研究，成功建立了穿心莲的扩繁体系;对穿心莲进行同源四倍体诱导和鉴定及有效成分的测定，成功获得同源四倍体植株，是解决穿心莲品种退化、产量和质量下降等多种问题的有效途径之一，为深入开展穿心莲良种选育等研究奠定基础。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献研究

1．1 穿心莲的研究概况

1．1．1 穿心莲的资源研究

1．1．2 穿心莲的组织培养研究

1．1．3 穿心莲的化学成分研究

1．1．4 穿心莲的药理研究

1．2 多倍体研究概况

1．2．1 多倍体诱导原理

1．2．2 多倍体的人工诱导方法

1．2．3 多倍体的鉴定方法

1．2．4 多倍体在中药材生产上的应用优势

第二章 实验研究

1．1 穿心莲种子无菌萌发及快速繁殖体系的建立

1．1．1 穿心莲种子无菌萌发的研究

1．1．2 穿心莲快速繁殖体系的建立

1．2 穿心莲同源四倍体的诱导、鉴别及有效成分含量测定研究

1．2．1 穿心莲同源四倍体诱导研究

1．2．2 穿心莲同源四倍体染色体倍性鉴别研究

1．2．3 穿心莲同源四倍体植株单株重及有效成分含量测定

第三章 结论与展望

1．1 结论

1．2 展望

参考文献

附录

英文缩略词

在校期间发表论文情况

致谢