芹菜素对SW620细胞葡萄糖吸收及多胺代谢的影响

摘要

目的:
　　芹菜素（apigenin，API）属于黄酮类。具有抑制致癌物质的致癌活性，芹菜素主要存在于瑞香科、马鞭草科、卷柏科植物中，如芫花，卷柏中含量较大。与其他黄酮类物质（槲皮素、山奈黄酮）相比具有低毒、无诱变性等特点。结肠癌(cancer of colon)是西欧、北美等发达国家最常见的恶性肿瘤，也是我国九大常见恶性肿瘤之一。在我国，因结肠癌死亡者，男性居恶性肿瘤死亡的第5位，女性居第6位。至今5年生存率仍徘徊于50％，有效的综合治疗或适当的辅助放疗、化疗是临床日益重视的方面，但至今仍有争议，未能见到令人振奋的结果。近年来众多学者努力寻求中西医结合治疗方法来提高患者的五年生存率。多胺有促进肿瘤细胞生长的作用，对于膜的正常维持也起着重要的作用，它们带有正电荷的氨基使它们和带有负电的磷酸基的DNA和RNA结合，促进植物细胞以及动物细胞中DNA的转录和RNA的翻译;它们能和膜上的蛋白质或磷脂结合，使膜保持其稳定性。本课题以结肠癌细胞SW620为模型，研究芹菜素抑制SW620细胞多胺代谢以及摄取葡萄糖能力的作用，为的预防和治疗提供新的思路。
　　方法:结肠癌
　　1细胞培养
　　按常规方法培养SW620细胞株培养于DMEM高糖培养基+10％ FBS+1％青链霉素双抗，于5％（ψ）CO2，37℃细胞培养箱内传代培养。
　　2对SW620细胞增殖的影响
　　以SW620细胞为研究对象，实验用10～80μmol·L-1不同浓度芹菜素作用于细胞，2.5 mmol·L-1的二氟甲基鸟氨酸(DFMO)作为阳性对照药，培养24，48，72 hr后，CCK-8法检测细胞增殖抑制情况;同时，倒置显微镜下观察细胞形态学变化。
　　3对SW620细胞SGLT1、GLUT1表达及葡萄糖摄取的影响
　　Real-Time PCR和Western blot检测不同浓度的芹菜素给药后SW620细胞SGLT1及GLUT1的mRNA及蛋白表达水平，葡萄糖测定试剂盒检测SW620细胞对葡萄糖摄取作用的影响。
　　4对SW620细胞多胺含量的影响
　　柱前衍生—高效液相色谱法(HPLC)检测不同浓度的芹菜素对细胞内多胺含量的影响。
　　5对SW620细胞ODC/SSAT表达的影响
　　Real-Time PCR和Western blot检测不同浓度的芹菜素给药后SW620细胞ODC及SSAT的mRNA及蛋白表达水平。
　　6对SW620细胞活性氧含量及凋亡的影响
　　流式细胞仪(Flow Cytometer，FCM)检测细胞内活性氧相对水平及细胞凋亡率，Hoechst33258检测细胞凋亡形态学变化。
　　结果:
　　1对SW620细胞增殖的抑制作用
　　不同浓度的芹菜素处理SW620细胞后，细胞生长受到不同程度的抑制，其抑制作用呈时间和浓度依赖性，且优于DFMO（2.5mmol·L-1）组，与对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)。细胞培养48 h后在倒置显微镜下观察，正常对照组SW620细胞呈短梭形，细胞透明，折光性较好，胞浆丰富透亮，细胞间连接紧密，细胞密度较大，极少见悬浮的死细胞及细胞碎片。芹菜素作用48 hr后观察，大体可见细胞密度明显减少，细胞内颗粒感增强，胞体变长，细胞间隙逐渐增宽，细胞界限模糊，胞浆减少，细胞脱落呈悬浮状，可见细胞碎片，存活细胞减少。
　　2对SW620细胞SGLT1、GLUT1表达及葡萄糖摄取的影响
　　与对照组比较，芹菜素作用于SW620细胞24，48，72h后，SW620细胞的葡萄糖消耗量明显减少(P＜0.05），当同一芹菜素浓度作用时间逐渐延长或同一作用时间芹菜素浓度逐渐升高时，其抑制SW620细胞摄取葡萄糖的作用逐渐增强，呈浓度和时间依赖性。而2.5mM的DFMO给药组对SW620细胞葡萄糖消耗有一定的影响，未见优于芹菜素。与对照组比较，GLUT1和SGLT1蛋白及mRNA随着芹菜素浓度的升高表达减少。
　　3对SW620细胞多胺含量的影响
　　与对照组相比，芹菜素作用于SW620细胞48hr后，细胞内的精胺含量明显减少(P＜0.01，P＜0.05)，腐胺含量明显增加(P＜0.01，P＜0.05)，总多胺含量呈现浓度依赖性的减少。而2.5mM的DFMO给药组作用于SW620细胞后，腐胺、精胺、精脒含量均有所减少(P＜0.01）。当二者联合使用时，总多胺含量呈现出明显的减少(P＜0.01)。
　　4对SW620细胞ODC/SSAT表达的影响
　　与对照组相比，SSAT的蛋白及mRNA随着芹菜素浓度的升高表达上调，而ODC的蛋白及mRNA水平与对照组并无显著性差异。表明芹菜素可能通过促进SSAT的表达来实现促进多胺代谢的功能，这与HPLC检测多胺含量变化的结果也是一致的。
　　5对SW620细胞ROS含量及凋亡的影响
　　FCM结果表明，与对照组相比，SW620细胞内的ROS含量及细胞凋亡率随芹菜素浓度的升高而增加。芹菜素作用后，晚期凋亡和坏死的细胞均明显多于对照组，且凋亡细胞数目随芹菜素的浓度增高而增加，呈现浓度依赖性。Hoechst33258染色后可见，对照组细胞核大，核内的荧光染色浅，且亮度均一，呈淡蓝色。不同浓度的芹菜素处理后可见细胞出现凋亡，细胞数目随芹菜素浓度增大而逐渐减少，出现细胞凋亡形态学改变，包括凋亡细胞核固缩，细胞核碎裂成块状、着色深而呈亮蓝色，生成凋亡小体。
　　结论:
　　1.对SW620细胞增殖的抑制作用
　　芹菜素能抑制对人结肠癌细胞株SW620细胞的增殖具有抑制作用，且具有浓度和时间依赖性。芹菜素作用24、48、72hr检测发现，随着芹菜素浓度增加，对细胞的抑制作用显著增强，10μM的芹菜素作用48hr时，SW620细胞的增殖受到明显抑制，表明10μM可能是芹菜素在体外发挥药效的最低浓度。这有助于为芹菜素抗结肠癌的进一步研究及其临床用药提供药效时间的依据。
　　2.对SW620细胞SGLT1通路及葡萄糖摄取的影响
　　葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)及钠依赖性葡萄糖转运载体(SGLT1)是目前已知体内分布最为广泛的两个葡萄糖转运体，其主要参与葡萄糖跨膜转运的正常生理过程，肿瘤细胞摄取葡萄糖增加主要通过增加GLUT1及SGLT1的跨膜转运，来实现自身对能量的高摄取。本实验通过检测SW620细胞葡萄糖消耗量，表明芹菜素作用后的SW620细胞葡萄糖消耗量均明显减少，且随着芹菜素浓度增加，其抑制SW620细胞摄取葡萄糖的作用越明显，具有剂量依赖性。与此相应，芹菜素同时也下调SW620细胞的GLUT1及SGLT1蛋白表达水平，故我们推测，芹菜素对SW620细胞的葡萄糖摄取的影响，可能是与抑制细胞增殖，调节GLUT1及SGLT1蛋白表达有关，这也可能是芹菜素抗肿瘤的作用机制之一。
　　.3对SW620细胞多胺含量的影响
　　多胺是一类广泛分布于组织细胞内的天然小分子脂肪族物质，包括腐胺(putrescine，Put)、精脒(spermidine，Spd)和精胺(spermine，Spm)，其中以精胺的活性及作用最强。多胺对哺乳动物细胞的生长，增殖及分化起到了重要的调控作用，而肿瘤组织中多胺含量远高于正常组织。本实验通过检测SW620细胞内的多胺含量，芹菜素作用后的SW620细胞精胺及精脒减少，腐胺稍有增多，总多胺含量减少，表明其促进了多胺的代谢分解，且随着芹菜素浓度增加，其促进SW620多胺代谢的作用越明显，具有剂量依赖性。
　　4.对SW620细胞ODC/SSAT表达的影响
　　鸟氨酸脱羧酶(Ornithine decarboxylase，ODC)是多胺合成的限速酶，对多胺的胞内合成起到至关重要的调控作用，而精胺/精脒-N1-乙酰基转移酶(spermidine/spermineN1-acetyltransferase，SSAT)为多胺分解代谢的限速酶。本实验通过检测SW620细胞内的ODC及SSAT的蛋白及mRNA的表达，表明芹菜素作用后的SW620细胞SSAT蛋白及mRNA表达上调，ODC与对照组并无明显差异，这与多胺含量改变也表现一致。
　　5.对SW620细胞ROS含量及凋亡的影响
　　多胺代谢分解过程中会产生次生代谢产物ROS，ROS的胞内积聚会诱导细胞凋亡荧光染色形态学变化来评定芹菜素对SW620细胞凋亡的影响。结果表明，芹菜素作用于SW620细胞48hr后，胞内ROS含量较对照组显著增加，同时出现细胞凋亡。这表明芹菜素通过诱导SW620细胞的多胺代谢分解从而诱导了细胞凋亡。

目录

声明

摘要

引言

1 芹菜素抗肿瘤作用研究进展

2 SGLT1与GLUT1在肿瘤细胞葡萄糖摄取中的作用

3 多胺代谢与肿瘤的关系

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三章 芹菜素对SW620细胞SGLT1、GLUT1表达及葡萄糖摄取的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第四章 芹菜素对SW620细胞多胺含量的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

结语

参考文献

附录

在校期间发表的论文情况

致谢