MeJA诱导白木香气雾根产生2-(2-苯乙基)色酮的研究

摘要

沉香为瑞香科Aquliaria，Gonystulus and Gyrinops等属树木的茎、枝或根受伤（自然条件下，风、雷电、虫咬或微生物侵染）后形成的黑色树脂木材，被认为是一种病理学产物。作为珍贵香料，沉香被世界性宗教如佛教、伊斯兰教和基督教等广泛推崇，也极具保健和收藏功用。作为传统药材，这种含树脂木材可制成止吐药、镇静剂及消化药。然而，野生沉香资源濒危和人工结香效率低的现状，难以满足市场需求。
　　多年来，众多研究者持续致力于高效沉香生产技术的开发，其中以探究和阐明沉香标志物成分——倍半萜和色酮类的合成过程为基础和关键环节，并已取得部分进展，但沉香色酮的形成机制尚不清楚。同时，在研究材料选择方面，以鲜木材为材料不仅实验周期长而且环境因素复杂且不可控，以悬浮细胞为材料则由于其异养和离体组织水平的本质特征，模拟自然结香过程的适合度较低。因此，本课题组以气雾不定根为材料，实现培养周期短及其完整性，并通过茉莉酸甲酯模拟外界伤害进而研究影响沉香2-(2-苯乙基)色酮的形成因素。
　　1.目的:
　　探索MeJA白木香气生根产生沉香色酮类次生代谢产物的过程，为其形成机制提供理论依据。
　　2.方法:
　　2.1气雾培养体系的构建
　　本实验选取一年生的白木香实生苗为起始材料，将苗从营养袋取出，清洗干净根部泥土后剪除所有侧根，再用0.1％ KMnO4消毒主根1 min。设计不同浓度(0.5、1.0、1.5 g·L-1)、不同种类的生长调节物质(NAA、IBA、ABT1)10s蘸根处理，作为气生根诱导实验方案。蘸根后立即转入气培系统，纯水培养第20 d统计相关指标。气生根发生后，将清水更换为不同电导率(0.6、1.2、2.4 dS·m-1)MS培养液进行根生长培养。并使用不同浓度(0、50、100、200μM) MeJA处理7d，利用GC-MS检测色酮类物质。
　　2.2白木香气生根的转录组数据分析
　　取50μM MeJA处理5天的不定根为材料，以空白处理为对照，分别提取总RNA后进行转录组测序挖掘影响色酮的生物合成的相关基因。
　　2.3气生根PCD与2-(2-苯乙基)色酮关系的初探
　　选定可诱导色酮代谢的50μM MeJA浓度对白木香不定根处理，在该进程不同时间点取材，进行显微观察、TUNEL及PI细胞凋亡检测、DNA降解及GC-MS检测实验，初步推测PCD与色酮之间的相关性。
　　3.结果:
　　3.1气雾培养体系的构建
　　将白木香实生苗土培根侧根剪除并经1.5g·L-1IBA处理后转换为清水气雾培养，可获得最佳的气生根生根率(86.67％)和生根量（32.87条·株-1），气生根在1.2 dS·m-1MS培养液中可旺盛生长积累最大生物量（1272.6士681.6 mg plant-1）。50μM MeJA浓度为最佳诱导浓度，能够诱导生产两种色酮，2-（2-苯乙基）色酮相对含量为2.56％，为标准药材的8倍左右，6-甲氧基-2-（2-苯乙基）色酮(0.45％)，而100和200μM仅诱导出2-（2-苯乙基）色酮，相对含量分别为0.23％和0.65％。
　　3.2转录组数据分析
　　借助Illumina HiSeqTM2000测序技术对3.2中MeJA处理0d和5d的气生根进行转录组测序，获得128878条unigenes，其中67604条至少在一个公共数据库(Nr、Swiss-prot、KEGG、KOG)中获得注释，注释率为52.45％。
　　以FDR＜0.05且|log2FC|＞1为筛选条件，共筛选出48777条差异基因，其中17039呈上调表达，31738呈下调表达。差异基因GO分类，以转录因子活性和蛋白结合功能表现显著上调，其余均为下调基因数多于上调基因。KEGG富集途径中苯丙烷类途径和萜类代谢均具有显著性，以核糖体代谢途径最为显著。
　　MeJA条件下，大量的差异基因注释为蛋白激酶、Ca2+和MAPKs，其中共有124个基因编码蛋白激酶分四大家族（LRR-RLK、CRR-RLK、SRK和PERK），能够调控多个植物逆境下生长发育过程;136个注释到与Ca2+相关基因（CaM、CML、CDPK和Ca2+ ATPase），是植物信号途径的第二信使并能够参与植物激素信号途径;43个差异基因注释为MAPK cascades(43)，包括MAPK(22)，MAPKK(10) and MAPKKK(11)，蛋白磷酸化和脱磷酸在许多信号传导途径为重要环节，蛋白激酶参与这些环节进而助于信号传输。表明这些蛋白参与MeJA胁迫信号传导。
　　防御相关基因往往受TFs的调控，因此TFs会在不同信号通路中发挥直接或间接作用。MeJA引起大量的转录因子的响应，实验中，我们发现313个差异基因注释为转录因子，大多数显著呈下调表达，包括主要包括WRKY(23)，MYB(31) and ERF(38)等，其中有多种TFs因MeJA处理呈上调表达，表明它们可能参与白木香不定根的次生代谢产物生物合成调控。这些信息有利于我们深入分析响应色酮的调控基因，为研究沉香色酮生物合成机制提供理论基础。
　　3.3气生根PCD与色酮关系的初步研究
　　相比MeJA处理0d和3d，5d和7d后的气雾根出现较为明显的通气组织，TUNEL和PI染色和DNA降解情况均表明PCD的发生，同时2-（2-苯乙基）色酮逐渐形成并积累，初步推测两者之间存在关联性。
　　4.结论:
　　本研究通过课题组构建的气雾培养体系下，利用MeJA诱导白木香气雾根产生2-（2-苯乙基）色酮，在此基础上，分子水平分析了影响色酮形成的相关基因，为探索沉香色酮形成机制提供一定的参考价值。

目录

声明

摘要

引言

研究背景

1 沉香形成机制的研究概述

1．1 白木香概述

1．2 沉香色酮的研究进展

1．3 沉香色酮类化合物成分及检测方法

1．4 沉香形成机制研究概述

2 胁迫诱导药用植物次生代谢产物的研究进展

2．1 生物因素与植物次生代谢的相关性

2．2 非生物因素与植物次生代谢的相关性

3 植物激素信号传导

3．1 乙烯

3．2 脱落酸

3．3 水杨酸

3．4 一氧化氮

4 转录组及荧光定量在植物次生代谢的应用

5 本文的研究思路

5．1 总体思路

5．2 技术路线

第一章 白木香气雾培养体系的初步建立

1．1 植物材料、主要仪器、试剂

1．1．1 植物材料

1．1．2 气雾培养设备

1．1．3 主要仪器和试剂

1．2 方法

1．2．1 气生根诱导及生长培养条件筛选

1．2．2 白木香气生根处理及样品制备

1．2．4 统计方法

1．3 结果与分析

1．3．1 激素处理对白木香气生根发生的影响

1．3．2 营养电导率对白木香气生根生长的影响

1．3．3 白木香气生根中沉香色酮物质的检测

1．4 小结与讨论

第二章 转录组测序分析

2．1 材料、主要仪器和试剂

2．1．1 材料

2．1．2 主要仪器

2．1．3 试剂

2．2 方法

2．2．1 转录组测序

2．2．2 转录组数据分析

2．2．3 统计方法

2．3 结果与分析

2．3．1 总RNA质量分析

2．3．2 测序评估

2．3．3 基因注释和分类

2．3．4 差异基因分析

2．3．5 响应MeJA胁迫相关基因分析

2．3．6 推测参与2-(2-苯乙基)色酮合成的相关基因

2．3．7 RT-qPCR验证

2．4 小结与讨论

第三章 白木香不定根PCD与2-(2-苯乙基)色酮关系的初探

3．1 材料、主要仪器和试剂

3．1．1 材料

3．1．2 主要仪器

3．2．4 DNA降解

3．2．5 GC-MS检测

3．3 结果与分析

3．3．1 显微观察

3．3．2 TUNEL标记及PI染色

3．3．3 DNA降解

3．3．4 GC-MS检测不同时间处理中色酮百分含量变化

3．4 小结与讨论

第四章 总结与展望

4．1 总结

4．1．1 初步构建白木香气雾培养体系

4．1．2 白木香转录组数据分析

4．2 展望

参考文献

附录

附图

在校期间发表论文情况

致谢