巴西橡胶树REF、RT和SRPP基因物理定位的研究

摘要

巴西橡胶(Hevea brasiliensis)是一种重要的产胶植物,其胶乳是目前工业用天然橡胶的唯一商业来源,是我国重要的战略物资,也是热带、亚热带地区的重要经济作物。前人已经对橡胶树产胶、抗逆性等相关性状开展了一系列研究,已从橡胶树中克隆了40多种重要基因或cDNA片段,但是这些基因的染色体定位却鲜见报道。基因的染色体定位对物理图谱的绘制、遗传连锁群和特定染色体的对应关系的建立、遗传图谱和物理图谱的整合具有重要的意义。本研究采用原位PCR技术对橡胶延长因子(REF)基因和利用荧光原位杂交技术(FISH)对橡胶转移酶(RT)基因和小橡胶粒子蛋白(SRPP)基因进行了物理定位的研究。主要结果如下:
　　 对橡胶树叶片的染色体标本制作方法进行了探索,建立了适合橡胶树叶片染色体标本制备的一整套方法。
　　 通过对前人的原位PCR技术进行改良,建立了适合巴西橡胶树基因特异DNA片段定位的原位PCR方法。改良后的原位PCR技术,具有背景低、假阳性低的特点。
　　 首次建立了巴西橡胶树单低拷贝基因的荧光原位杂交技术体系:杂交液总体积为20μl,各组分的终浓度为:50％去离子甲酰胺,10 ng/μl探针,10％硫酸葡聚糖,2×SSC,250 ng/μl鲑鱼精DNA,0.5％SDS；操作流程为0.1 M HCl2 min→胃蛋白酶处理10 min→94℃水浴1 min→70％甲酰胺70℃变性2 min→乙醇脱水→杂交液变性、冰浴→共变性→杂交→信号检测。
　　 利用改良后的橡胶树原位PCR技术,首次对产胶相关基因REF基因进行了染色体定位。在热研7-33-97不同分裂时期的细胞中均扩增到2个信号,初步将REF基因定位于热研7-33-97中期细胞第3号染色体长臂上,信号位点到着丝粒的百分距离是34.51。
　　 构建了橡胶树的双色荧光原位杂交技术体系,并用所构建的技术将RT基因和SRPP基因同时定位到了热研7-33-97的染色体上。其中RT基因被初步定位在热研7-33-97第6号染色体的长臂上,信号位点到着丝粒的百分距离是42.02；SRPP基因被初步定位在热研7-33-97第8号染色体的长臂上,信号位点到着丝粒的百分距离分别是56.93。

目录

文摘

英文文摘

1 前言

1.1 橡胶树种质资源概述

1.2 巴西橡胶树REF、RT、SRPP基因的国内外研究现状

1.2.1 橡胶延长因子(Rubber Elongation Factor,REF)

1.2.2 橡胶转移酶(Rubber Transferase,RT)

1.2.3 小橡胶粒子蛋白(small rubber particle protein,SRPP)

1.3 橡胶核型研究进展

1.4 植物原位PCR的研究进展

1.4.1 原位PCR的基本原理

1.4.2 植物原位PCR技术的主要操作步骤

1.4.3 植物原位PCR应用进展

1.5 植物荧光原位杂交技术的研究进展

1.5.1 荧光原位杂交技术的主要操作步骤

1.5.2 多色荧光原位杂交技术

1.5.3 植物原位杂交的应用进展

1.6 橡胶树基因定位研究进展

1.7 本研究的目的意义和技术路线

1.7.1 本研究的目的意义

1.7.2 技术路线

2 材料和方法

2.1 试验材料与试剂

2.1.1 供试材料

2.1.2 主要的仪器

2.1.3 试剂

2.2 试验方法

2.2.1 染色体标本的制备

2.2.2 橡胶树DNA提取

2.2.3 特异引物合成与筛选

2.2.4 原位PCR技术流程

2.2.5 荧光原位杂交技术流程

2.2.6 信号位置的确定

3 结果与分析

3.1 橡胶树染色体制片技术体系的优化

3.2 基因特异DNA序列的扩增与分析

3.2.1 橡胶树基因组DNA的提取

3.2.2 基因特异DNA序列的PCR扩增与测序结果

3.3 原位PCR体系的优化

3.3.1 甲酰胺的处理

3.3.2 后处理的优化

3.4 橡胶树荧光原位杂交技术体系的建立

3.4.1 探针的制备及标记效果的检测

3.4.2 标本预处理的优化

3.4.3 橡胶树基因特异DNA序列的荧光原位杂交体系的建立

3.5 橡胶树REF、RT和SRPP基因的染色体定位分析

3.5.1 橡胶树REF基因的原位PCR和FISH分析

3.5.2 橡胶树RT和SRPP基因的FISH定位分析

4 讨论

4.1 关于染色体标本制备的问题

4.2 关于原位PCR技术的改进

4.3 关于FISH技术的信号问题

4.4 关于原位PCR与FISH检测的灵敏度

5 结论

参考文献

附录 试剂的配制

论文说明:缩略语

致谢