新疆达坂盐湖沉积土壤嗜盐细菌的多样性分析及钠离子输出相关基因的克隆

摘要

嗜盐菌由于具有广泛的环境适应多样性、系统发育多样性、独特的耐盐机制和潜在应用价值,近年来受到科学界的广泛关注。本研究以新疆达坂盐湖沉积土壤为实验材料,对新疆达坂盐湖的嗜盐细菌进行多样性分析,并从中克隆获得1个新的钠离子输出相关基因。主要研究结论如下:
　　 以选择性富集培养获得的嗜盐细菌基因组DNA为模板,扩增16S rRNA基因,在此基础上构建嗜盐细菌的16S rRNA基因文库,随机挑选文库中的100个阳性克隆子进行群落结构多样性分析。16S rRNA基因序列分析结果表明:100个克隆分属于细菌域9个属的27个种,其中芽孢杆菌(Bacillus)为优势菌群(48％),喜盐芽孢杆菌(Halobacillus)(14％)、嗜盐单胞菌(Halomonas)(13％)为次优势菌群。分析的阳性克隆子中,10个克隆子与GenBankr扣已报道16S rRNA基因序列的相似性在88.80％到96.90％之间,可能代表新属或新种。研究结果表明,新疆达坂盐湖沉积土壤的富集培养物中存在种类较为丰富的嗜盐细菌。
　　 以大肠杆菌Na+/H+逆向转运蛋白基因缺陷株Escherichia coil Knabc为宿主,通过功能互补方法,从经Sau3AI部分酶切回收的总基因组DNA中筛选到1个新的钠离子输出相关编码基因smrL。序列分析表明:smrL基因预测编码含104个氨基酸、具有3个推测跨膜区的蛋白,与Sphaerobacter thermophilus中的药物/H+逆向转运蛋白SugE之间存在59％的同源性。smrL是从富集培养物的总基因组DNA中克隆得到的第一个钠离子输出相关基因。
　　 携带smrL基因的大肠杆菌Knabc重组子,分别在含有不同浓度NaCl和LiCl的培养基中进行盐耐受性实验,以及在pH7.0-8.0的培养基中进行碱耐受性实验。研究结果表明,smrL能增强Knabc菌株对NaCl和碱性pH的抗性,但是没有LiCl抗性。

目录

文摘

英文文摘

1 序言

1.1 极端微生物简介

1.1.1 极端微生物的主要生物类群

1.1.2 极端微生物的应用

1.2 嗜盐菌的研究概况

1.2.1 嗜盐菌的定义和分类

1.2.2 嗜盐菌栖息的盐域环境

1.2.3 嗜盐古菌的研究历史

1.2.4 中度嗜盐菌的研究历史

1.2.5 嗜盐菌的研究热点

1.3 嗜盐微生物的盐适应机制

1.3.1 通过提高胞质缓冲力来适应高盐环境

1.3.2 次级钠泵系统

1.4 Na+/H+逆向转运蛋白的应用前景

1.5 微生物Na+/H+逆向转运蛋白亟待研究的问题

1.6 本研究的指导思想、目的和意义

1.7 本研究的技术路线

2 新疆达坂盐湖沉积土壤嗜盐细菌的多样性分析

2.1 材料和方法

2.1.1 样品的采集和处理

2.1.2 主要仪器和实验用品

2.1.3 菌株和载体

2.1.4 培养基

2.1.5 主要试剂

2.1.6 实验方法

2.2 结果与分析

2.2.1 总基因组DNA的提取

2.2.2 嗜盐富集培养物16S rRNA基因多样性及其系统发育分析

2.3 讨论

3 微生物钠离子输出相关基因的克隆与功能研究

3.1 材料与方法

3.1.1 样品的采集和处理

3.1.2 菌株、质粒和引物

3.1.3 主要仪器和实验用品

3.1.4 培养基

3.1.5 碱法提取质粒所需主要试剂

3.1.6 实验方法

3.2 结果和分析

3.2.1 总基因组DNA的部分酶切

3.2.2 阳性克隆子的筛选

3.2.3 重组质粒携带外源基因的序列分析

3.2.4 Na+输出相关基因的亚克隆

3.2.5 E.coli KNabc/pMDtetR-smrL的耐盐性实验

3.2.6 E.coli KNabc/pMDtetR-smrL对碱性pH的抗性

3.3 讨论

结论

参考文献

论文说明:缩略词一览表

致谢

项目资助与论文发表情况