河西走廊芦苇根际土壤耐盐链霉菌的分离、鉴定及抗菌活性研究

摘要

链霉菌(Streptomyces)作为一种广泛分布于土壤中的常见微生物,在分类学地位上属于一类高G+C的革兰氏阳性放线菌,因其能产生药用抗生素等天然活性物质而倍受关注。近年来为解决病原菌耐药性难题,从极端环境中分离产新抗生素的链霉菌新种,成为研究的焦点。本论文对采自甘肃省河西走廊中段临泽地区4种典型生态型芦苇(Phragmites communis)根际与非根际8份盐碱土壤样品进行了链霉菌的分离及筛选,16S rRNA基因序列分子鉴定和抗菌活性测定,最后对已鉴定的具有强抗菌能力的10株菌进行了最适生长盐度测定等研究。旨在探究河西走廊沙漠南麓临泽盐碱区芦苇根际及根周土壤中潜在的链霉菌及其抗菌活性,以期发现新药用链霉菌资源,丰富链霉菌资源库并为新型抗生素的开发奠定一定基础。取得了以下研究成果。
　　1.链霉菌的分离、纯化。采用稀释涂布法与平板划线法共筛选出355株菌。1 mol/L NaCl条件下分到285株,此盐环境中分布了大量的链霉菌群落,尤其以水生芦苇根际土壤(SR-R)与沙丘生芦苇根际土样(DR-R)最占优势。2 mol/L NaCl条件下分得70株,以重度盐碱草甸芦苇根际土壤(HSMR-R)居多,轻度盐化草甸芦苇根际土样(LSMR-R)次之。从培养特征看,SR-R与水生芦苇非根际土样(SR-BS)中存在的链霉菌多属于白孢类群、灰褐类群、烬灰类群和吸水类群,且SR-R中的菌株在后期多数能产生可溶色素和出现菌丝自溶现象,而SR-BS中的菌株孢子丝出现了高度分化以致形态差异较大。DR-R中的菌株以粉孢类群、灰红紫类群为主,烬灰类群次之,且大部分菌株气丝生长量少甚至无菌丝生长,表现出较为湿润的菌落表面。DR-BS中以白孢类群、蓝色类群为主,少数菌生长后期在培养基上呈现出透亮水解圈。LSMR-R与HSMR-R中筛出的菌株较1 mol/L NaCl下分得菌株个体小且菌落表观色泽暗淡,以灰红紫类群、灰褐类群与白孢类群为主。
　　2.菌株的16S rRNA基因分子鉴定。采用序列分析法对分离出的105株菌进行分子鉴定,测序结果经Blast比对显示,95.24％以上的鉴定菌株都为链霉菌属且相似度高达98.00%以上。菌株SR-BS2、SR-BS21、DR-R8、DR-R36、DR-R40与模式菌的相似度较低,约97.16%-97.93%之间,有可能为潜在新种。盐化(SMR)土样中所分出的几株菌经鉴定有5株为拟诺卡氏菌。构建系统发育树,分析与模式菌独聚成一枝且具高同源性的菌,通过种间的亲缘关系确定出同分支上的两者属于同一个种。并解读出了其他各菌株的分类地位与进化程度。菌株SR-R18与S. variabilis NBRC12825T有100%的亲缘关系;SR-R27与SR-R35同S. viridodiastaticus NBRC13106T和S. variabilis strain173893聚集成枝,且同源性分别为99.63%、98.98%;DR-R31与S. luteogriseus strain NBRC13402表现出很近的亲缘关系,但两者的同源性却只有92.91%。
　　3.链霉菌抗菌能力测定。采用琼脂块转移培养法对230株链霉菌进行拮抗性实验。共有185株具有抗细菌活性,占到分离菌总数的52.11%,其中具有广谱拮抗性的147株菌,占到链霉菌活性菌株的79.46%。在抗菌初筛实验中,从1mol/L SR-R与2mol/L LSMR-R中分得的链霉菌占据主要优势且抑菌能力强,1mol/L SR-BS中的菌株抑制效果次之。具有中、强抗菌能力的链霉菌菌株,以烬灰类群、吸水类群与蓝色类群居多, SR-R与SR-BS中的菌株主要为S. variabilis, S. griseorubens, S. griseoincarnatus, S. coeruleorubidus,S. coelicolor等,DR-R中还有S. coeruleorubidus,S. coerulescens,S. azureus等,DR-BS中还包括S. coeruleofuscu,S. anandii。2 mol/L LSMR-R中的拮抗菌以S. griseorubens与S. mutabilis居多。表明在甘肃临泽干旱沙漠区的不同生态芦苇根际与非根际土壤中蕴藏了丰富的药用链霉菌资源。
　　4.耐盐性测定。测试链霉菌的最适生长盐度范围为1%-10%,当增加到10%-12.5%时,中度耐盐链霉菌能正常生长。12.5%-15%间有少数菌能继续存活,但基本不生长。随着盐度的升高,菌体干重整体出现降低趋势,菌株DR-BS15的干重与盐浓度呈显著负相关。菌株SR-R56、SR-BS9、DR-R43、LSMR-R1-2M和HSMR-R38-2M在15%的盐度中延滞期长且于第6d开始进入对数期,15%时菌体量开始增加表明它们可能是一些高度耐盐菌,尤以HSMR-R38-2M表现最为明显。当盐浓度低于7.5%时,菌株DR-R27和DR-R43在第7d进入稳定期,而盐浓度高于12.5%时才开始进入对数增长期,且在第7d仍表现为继续上升趋势,表明这两株菌在高于15%的盐度下仍能生长。随着盐度的增加,各菌株延滞期逐渐变长且对数期的增长率减慢。菌株DR-BS15、LSMR-R1-2M、HSMR-R38-2M因适应期较短,稳定期长,均可为后续抗生素的工业化生产提供一定参考价值。
　　以上结果表明,在河西走廊盐碱沙漠化芦苇土壤中存在大量且具有高效抗菌活性的链霉菌资源,它们不仅抑制细菌且对植物病原菌也有一定拮抗效果。另外,对一定盐分具有较强耐受性。这些结论对从极端环境中开发新药用链霉菌有指导意义。

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1 绪 论

1.1 链霉菌研究概况

1.2 链霉菌次级代谢物的应用研究

1.3 研究内容、目的及意义

2 材料与方法

2.1 样品采集

2.2 主要药品及仪器

2.3 实验方法

3 结果与分析

3.1 耐盐链霉菌分离数量、分布与培养特征

3.2 链霉菌的16S rRNA基因分子鉴定及系统发育地位的确定

3.3 链霉菌拮抗能力测定

3.4 部分链霉菌的耐盐性

4 讨论与结论

4.1 链霉菌在不同生态型芦苇土壤中的分布

4.2 分离链霉菌的16S rRNA基因鉴定及其系统进化

4.3 盐碱荒漠地域中具有潜在的药用链霉菌资源

4.4 链霉菌对NaCl的耐受性

4.5 结论

4.6 展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果