荧光定量聚合酶链反应诊断甲型副伤寒的应用研究

摘要

目的：通过观察血培养、Widal reaction（肥达反应）、脂多糖-被动血凝试验（LPS-PHA）及荧光定量聚合酶链反应（PCR）在临床高度怀疑为甲型副伤寒沙门菌感染发热患者中的检出阳性率，初步探讨荧光定量PCR早期诊断甲型副伤寒的临床价值，并评价荧光定量PCR特异性、敏感性和可重复性。 方法： （1）采用硅胶材料制成的HiBind膜基质结合离心柱技术对甲、乙、丙型副伤寒沙门菌、伤寒沙门菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌及福氏志贺菌七株标准菌株，分别提取DNA。再分别加入甲型副伤寒沙门菌鞭毛抗原基因序列的特异性引物及探针，相同条件下同时进行荧光定量PCR扩增。并进行敏感性及重复性实验。 （2）30例临床高度怀疑为甲型副伤寒的发热患者为甲型副伤寒组，分别进行血培养、肥达反应、LPS-PHA及荧光定量PCR四种方法检测。11例明确为其它原因导致发热的患者为对照组，进行荧光定量PCR检测。将甲型副伤寒以1×105Copies/ml分为高DNA载量组和低DNA载量组，比较两组与血培养、肥达反应及LPS-PHA结果的关系。 结果：（1）七株标准菌株中仅甲型副伤寒沙门菌标准菌株荧光定量PCR结果为阳性，而其他非甲型副伤寒沙门菌标准菌株结果均为阴性。甲型副伤寒沙门菌标准菌株DNA经过逐级倍比稀释后进行荧光定量PCR扩增，最低检测下限达1×102Copies/ml。将1×108、1×107、1×106Copies/ml三个梯度每个梯度重复三次进行荧光定量PCR检测。结果显示1×106Copies/ml：22．22±0．50；1×107Copies/ml：17．49±0．34；1×108Copies/ml：12．69±0．18。（2）荧光定量PCR检测30例高度怀疑为甲型副伤寒发热患者，22例为阳性，对照组中11例均为阴性。两组间差异有统计学意义（P=0．000）。甲型副伤寒组30例患者通过四种方法检测的阳性检出率分别为27％（8/30）、23％（7/30）、17％（5/30）和73％（22/30）。荧光定量PCR与血培养、肥达反应、LPS-PHA间比较差异有显著性（均P<0．0083），而血培养、肥达反应、LPS-PHA间比较无统计学意义（均P>0．0083）。 （3）对病程第1周的12例患者进行四种方法分析，阳性检出率分别为25％（3/12）、17％（2/12）、17％（2/12）和67％（8/12），经统计学处理，四种方法差异有显著性（P<0．05）。 结论：荧光定量PCR是一种快速、敏感和特异的诊断方法，优于血培养、肥达反应、LPS-PHA传统实验室诊断方法，为甲型副伤寒的临床早期诊断提供了客观依据。

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综述：伤寒副伤寒实验室诊断研究进展

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