短发来RNA表达载体对2型单纯疱疹病毒UL54干扰效应的研究

摘要

目的:针对2型单纯疱疹病毒(Herpessimplexvirustype2,HSV-2)UL54基因构建短发夹RNA(smallhairpinRNA,shRNA)表达载体,采用脂质体转染法介导表达载体转入人胚胎肾293株(HumanEmbryonicKidneycells,HEK293)细胞,在体外细胞水平上观察shRNA表达载体对HSV-2UL54基因表达的影响,以及对HSV-2在HEK293细胞中复制的影响。
　　 方法:针对HSV-2UL54基因筛选出5条拟干扰位点,构建5个抑制UL54基因的短发夹RNA的真核表达载体,分别命名为shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4、shRNA5,以及不针对任何序列的阴性表达载体shRNANC。通过脂质体介导表达载体转染HEK293细胞,48小时后再接种HSV-2。采用荧光定量RT-PCR技术检测UL54mRNA的转录水平,终点滴定法检测细胞上清液中的病毒滴度。
　　 结果:(1)酶切和测序鉴定重组表达载体shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4、shRNA5、shRNANC构建成功;(2)荧光定量RT-PCR结果显示,与空白组(未转染重组表达载体),shRNA1、shRNA4、shRNA5均不同程度降低UL54mRNA的表达水平(P＜0.05)。(3)终点滴定法结果显示shRNA1、shRNA4、shRNA5可不同程度降低上清液中的病毒滴度((P＜0.05)。
　　 结论:成功构建shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4、shRNA5重组表达载体,shRNA1、shRNA4、shRNA5能在体外细胞水平上不同程度的干扰HSV-2UL54基因表达,抑制HSV-2在HEK293细胞中复制,为进一步利用RNAi技术抗HSV-2的研究提供参考数据。