甲苯噻嗪对超级化激活的环腺苷酸门控阳离子通道影响的实验研究

摘要

目的：
　　 建立膜片嵌实验中适于记录超极化激活环核苷酸门控(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated，HCN)阳离子通道产生的超极化激活电流(hyperpolarization-activated currents，Ih)[1]的方法，重组HCN1基因PCE-HCN1质粒DNA，重组HCN2基因PCE-HCN2质粒DNA经瞬时转染经培养的HEK293细胞，HEK293细胞表达HCN离子通道，研究甲苯噻嗪对HCN1离子通道，HCN2离子通道的影响。
　　 方法：
　　 重组HCN1质粒DNA或重组的HCN2质粒DNA经脂质体瞬时转染哺乳动物细胞构建稳定表达HCN1或HCN2离子通道的细胞模型，选取细胞表面光滑，贴壁良好，圆形的细胞进行电生理实验。首先按预先设定的刺激方案来干预细胞，诱导出Ih电流，然后分别给予12.5um/L甲苯噻嗪，25um/L甲苯噻嗪，50um/L甲苯噻嗪，100um/L甲苯噻嗪，记录甲苯噻嗪对HCN1和HCN2离子通道动力学的影响，得到Ⅰ-Ⅴ曲线，通道的激活曲线，统计甲苯噻嗪对HCN1离子通道和HCN2离子通道电流抑制幅度；并计算出甲苯噻嗪对HCN1V1/2和HCN2V1/2(V1/2是离子通道激活50％时的膜电位)电压的偏移；计算出不同溶度的甲苯噻嗪在生理电压下(-90mv)对HCN1和HCN2通道电流的抑制率，同时对比相同浓度下甲苯噻嗪对HCN离子通道不同亚型HCN1与HCN2离子通道的敏感性。
　　 结果：
　　 经瞬时转染HEK293细胞能产生稳定表达HCN1或HCN2离子通道的细胞模型，细胞质量好，形态结构规则，有60个细胞成功的记录到Ih电流并最终完成全部实验。甲苯噻嗪在不同的浓度下减小了HCN1的电流，使得HCN1的Ⅰ-Ⅴ曲线上移，甲苯噻嗪在12.5um/1到100um/L的临床浓度范围内，使得HCN1V1/2从-83.31±2.74mv向-99.83±5.08mv偏移(n=6，p<0.05)，我们发现在正常生理条件电压下(-90mv)，甲苯噻嗪在12.5um/l到100um/L的临床浓度范围内抑制了HCN1电流幅度分别为9％±0.06到42％±0.16(n=6，p<0.05)。有趣的是，甲苯噻嗪不但抑制了HCN1通道而且对HCN2离子通道也很敏感，使得HCN2的Ⅰ-Ⅴ曲线上移，使得HCN2V1/2从-98.55±3.93mv向-110.65±3.78mv偏移(n=6，p<0.05)，同时甲苯噻嗪在正常生理条件电压下(-90mv)12.5um/l到100um/L的临床浓度范围内也抑制了HCN2电流幅度分别为27%±0.05到70%±0.11(n=6，p<0.05)。甲苯噻嗪在正常生理条件电压下(-90mv)与相同的浓度范围内分别作用HCN离子通道不同亚基HCN1与HCN2离子通道，发现甲苯噻嗪对HCN2离子通道的作用更敏感。
　　 结论：瞬时转染的HEK293细胞能构建稳定表达的HCN离子通道，转染后的细胞存活率高，细胞膜完整，细胞表面光滑，能够用于记录HCN1离子通道与HCN2离子通道产生的Ih电流。甲苯噻嗪能显著的抑制HCN1离子通道和HCN2离子通道，提示其可能是甲苯噻嗪的麻醉作用机制之一。随着甲苯噻嗪的浓度增加，其对HCN离子通道产生的Ih电流抑制逐渐增大，因此甲苯噻嗪对HCN离子通道的抑制作用呈现剂量依赖性。