αA晶体蛋白基因启动子与HSP70基因融合表达载体构建及其在半乳糖诱导大鼠晶状体组织的表达

摘要

目的:构建αA晶体蛋白基因启动子（αACP）与HSP70基因融合表达载体pαACP-HSP70，并检测其在半乳糖诱导的大鼠晶状体组织的表达及其对半乳糖诱导大鼠晶状体组织抗氧化系统的作用。
　　 方法:利用PCR技术从pIRES2-EGFP-HSP70中扩增HSP70，用XhoⅠ和BamH I分别酶切扩增产物和pαACP-IRES2-EGFP载体，回收目的片段再连接构建αACP启动子启动的含HSP70基因的特异性表达载体pαACP-HSP70，通过酶切、PCR检测及测序证实其构建成功。利用脂质体转染法将质粒pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP-HSP70、pαACP-HSP70分别导入半乳糖诱导的大鼠晶状体组织，以生理盐水作为空白对照。通过荧光显微镜直接观察绿色荧光蛋白基因(EGFP)的表达，western blot检测HSP70基因在大鼠晶状体组织中的表达;用SOD试剂盒及GSH-Px试剂盒分别检测晶状体抗氧化系统中SOD、GSH-Px活性的变化。
　　 结果:(1)构建的pαACP-HSP70质粒通过酶切图谱鉴定、PCR检测有1924bp条带出现，通过测序显示所克隆的HSP70基因与基因库中的同种序列比较，核苷酸序列有100％的同源性。(2) pIRES2-EGFP组、pHSP70组、pαACP-HSP70组在大鼠晶状体组织均可直接观察到绿色荧光，且pαACP-HSP70组荧光强度最强，与pIRES2-EGFP组、pHSP70组的差异均有显著性(P＜0.01)，NS组未见荧光蛋白表达。(3) western blot检测显示外源性HSP70基因可在大鼠晶状体组织表达。(4)在高糖刺激下晶状体中SOD及GSH-Px活力明显下降，pαACP-HSP70组与其他组相比SOD、GSH-Px的活性显著升高(P＜0.01)，与NS组比较分别增加了1.41倍和13.65倍。
　　 结论:成功构建了晶状体上皮细胞特异性表达载体pαACP-HSP70;该表达载体导入大鼠晶状体组织内可表达外源性HSP70基因;外源性HSP70能改善高糖诱导的白内障的晶状体的抗氧化系统活力。

目录

声明

英汉缩略词对照表

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

2．实验方法

结果

1 αA晶体蛋白基因启动子驱动的HSP70基因特异性表达载体的构建

2 pαACP-HSP70在高糖环境下大鼠晶状体组织的表达

3 pαACP-HSP70对大鼠晶状体抗氧化系统的作用

讨论

1 pαACP-HSP70晶状体上皮细胞特异性表达载体的构建

2 pαACP-HSP70质粒在大鼠晶状体上皮细胞的表达

3 pαACP-HSP70对半乳糖诱导的大鼠晶状体抗氧化系统的作用

结论

参考文献

综述

致谢

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