重组腺病毒AD-FLT-1/PC对糖尿病肾病动脉粥样硬化大鼠保护作用的实验研究

摘要

目的:本研究旨在探索靶向增强血管内皮细胞蛋白C(PC)表达对糖尿病肾病伴动脉粥样硬化大鼠的保护作用。通过以重组腺病毒为载体，将带有绿色报告基因及内皮细胞特异性的重组腺病毒Ad-FLT-1/PC，以尾静脉注射的方式导入糖尿病肾病动脉粥样硬化大鼠体内，观察目的基因PC在血管壁的分布、表达以及活化为APC的情况。从细胞凋亡、炎症反应及氧化应激的角度，深入研究APC对糖尿病肾病动脉粥样硬化的作用及机制，为糖尿病肾病伴动脉粥样硬化的干预措施提供一定的理论依据。
　　 方法:
　　 1.构建糖尿病肾病(DN)动脉粥样硬化大鼠模型SD大鼠，雄性，体重180-200g，随机分成正常对照组和模型组。模型组高脂饮食1月后，腹腔注射STZ40mg/kg，正常组正常饮食1月后，注射同等量的PBS。以7天血糖≥16.7mmol/l为糖尿病成模标准。成模大鼠继续喂养高糖高脂饮食至16周。动态监测血糖、血脂、尿蛋白、血肌酐、血尿素氮、血浆APC的变化以及肾脏与血管的病理改变。
　　 2.研究重组腺病毒Ad-FLT-1/PC对DN动脉粥样硬化的作用将成模大鼠随机分成三组:Ad-FLT1/PC组(23只)、Ad-GFP组(23只)及NS组（22只），并以正常SD大鼠作为对照(23只)。分别在转染后1天、3天、7天及14天，每组随机取5-6只大鼠处死，快速冰冻切片观察血管壁荧光分布，分别用RT-PCR、免疫组织化学(IHC)方法检测PC mRNA及PC蛋白在血管壁上的表达情况，ELISA检测血浆中蛋白C的活化水平;IHC检测血管壁TNF-a、ICAM-1蛋白的表达量;TUNEL法检测细胞凋亡;WST法及TBA法分别检测血浆SOD、MDA含量。
　　 结果:
　　 1.实验大鼠基本情况:实验过程共有11只大鼠死亡，未成模有8只，68只大鼠造模成功。成模大鼠血糖增高明显，出现明显的“多饮、多食、多尿及体重减轻”等症状。且随着造模时间的延长，血脂、尿蛋白、血肌酐及血尿素氮等指标较正常组出现明显异常。造模第8周，肾脏从轻度系膜增生到后期的基底膜增厚，毛细血管腔狭窄;造模第12周，血管壁开始出现AS病变，至16周末，血管内膜明显增厚，平滑肌细胞增生明显，排列紊乱，甚至出现管腔狭窄的表现。
　　 2.通过尾静脉注射重组腺病毒Ad-FLT-1/PC后，3天可观察到绿色荧光在血管内皮层表达，且荧光至少能持续表达至14天;转染后1天到14天，RT-PCR可检测Ad-FLT-1/PC组血管壁均有不同程度的PCmRNA的表达，余三组未见其表达。IHC显示转染Ad-FLT1/PC重组腺病毒3天后，可见血管内皮层PC表达量增加，均明显高于Ad-GFP组与NS组水平(P＜0.05);转染1天、3天、7天及14天4个观察点，Ad-FLT-1/PC组血浆APC水平均比Ad-GFP组与NS组升高（P＜0.05）。
　　 3.血管壁TNF-a、 ICAM-1的检测:转染7天后，IHC显示Ad-FLT1/PC组血管壁的TNF-a、 ICAM-1显著低于Ad-GFP组与NS组(P＜0.05); GFP组与NS组之间各时间点均无差异（P＞0.05）。
　　 4.血管壁细胞凋亡的检测:在各时间点，正常组几乎未见细胞凋亡的发生，而Ad-FLT1/PC组、GFP组及NS组均可在血管壁上观察到细胞凋亡的发生，且各时间点凋亡发生率均无统计学差异（P＞0.05）。
　　 5.转染14天后，Ad-FLT-1/PC组血浆SOD的量较Ad-GFP组及NS组增高(P＜0.05)，而血浆MDA的量较其2组含量减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 1.STZ腹腔注射联合高糖高脂饮食喂养大鼠，可成功构建糖尿病肾病动脉粥样硬化模型。
　　 2.Ad-FLT1/PC经尾静脉注射糖尿病肾病动脉粥样硬化大鼠，PC可在血管内皮细胞表达并有效激活，使体内血浆APC表达量增加。
　　 3.血浆APC表达量增加可能通过下调炎症介质、粘附因子表达以及抑制氧化应激反应发挥保护内皮细胞的作用，为DN动脉粥样硬化的发生机制提供新思路。

目录

声明

英文缩略词表

摘要

前言

实验一 糖尿病肾病动脉粥样硬化大鼠模型的构建

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

实验二 重组腺病毒Ad-FLT-1／PC对糖尿病肾病动脉粥样硬化大鼠保护作用的实验研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

综述

致谢

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