小鼠口服水凝胶包裹防龋DNA疫苗pVAX1-spap/A后Tfh细胞的变化及意义

摘要

目的：观察滤泡辅助性T细胞（T follicular helper cells, Tfh cells）及其分泌的IL-21细胞比例在小鼠口服防龋DNA疫苗后的免疫效应过程中是否发生变化，并初步探讨其意义。
　　方法：本研究包括两部分：
　　第一部分：重组质粒pVAX1-spap/A和空载体pVAX1的鉴定及大量制备。
　　1.将菌种进行复苏及扩大培养后，提取质粒pVAX1-spap/A和空载体pVAX1。
　　2.将提取后的质粒pVAX1-spap/A和空载体pVAX1进行限制性内切酶双酶切鉴定，判断所提取质粒是否为本实验所需质粒。
　　3.在鉴定所提取质粒为正确质粒后，大量抽提质粒pVAX1-spap/A和空载体pVAX1，利用紫外分光光度计测定所提取质粒的OD值，并记录其浓度及纯度，以备免疫小鼠。
　　第二部分：口服水凝胶包裹防龋DNA疫苗pVAX1-spap/A免疫小鼠。
　　63只4-6周龄BALB/c雌性小鼠，随机将其分为四个小组，分别为(1)空白对照组9只：口服生理盐水；(2)阴性对照组18只：口服水凝胶包裹pVAX1空载体质粒；(3)水凝胶组18只：口服水凝胶；(4)实验组18只：口服水凝胶包裹pVAX1-spap/A质粒。通过灌胃法共免疫三次，每次免疫间隔一周，空载组与实验组小鼠每次免疫剂量为：200ug/只，用0.8ml水凝胶包裹。分别于免疫后的第7、14、21天进行小鼠内眦后取血，用血清通过ELISA间接法检测小鼠血清中特异性IgG抗体免疫前后的变化水平情况，来判断机体口服疫苗后是否发生了免疫效应，同时取小鼠的脾脏和肠系膜淋巴结并制备成细胞悬液后通过流式细胞术检测Tfh细胞比例及其功能性分子IL-21表达情况。
　　结果：
　　1.经酶联免疫吸附实验证明，初次免疫小鼠后第1周，实验组的血清特异性IgG抗体水平开始升高(0.354±0.117)，初次免疫小鼠后第2周，实验组的血清特异性IgG抗体水平达到高峰(0.611±0.125)，初次免疫小鼠后第3周，实验组的血清特异性IgG抗体水平开始下降(0.589±0.034)。在免疫小鼠的三周内，实验组相较其他三个对照组明显升高(P<0.05)。其余三组对照组在免疫小鼠的三周内血清特异性IgG抗体水平无明显变化趋势(P>0.05)。
　　2.经流式细胞术实验证明，在初次免疫后的第1周，实验组脾脏的Tfh细胞比例升高，但是与其它三组对照组间差异不大(P>0.05)。实验组肠系膜淋巴结的Tfh细胞比例与其他三组间比较显著升高(P<0.05)。初次免疫后的第2周，实验组脾脏和肠系膜淋巴结中的Tfh细胞比例都继续升高且达到高峰，并显著高于其它三组对照组(P<0.05)。初次免疫后的第3周，实验组脾脏的Tfh细胞比例开始下降，但仍高于其它三组，其中与空白组相比较差异有统计学意义(P<0.05)。实验组肠系膜淋巴结的Tfh细胞比例开始下降，但仍高于其它三组，其中与水凝胶组和空载组相比较差异有统计学意义(P<0.05)。在初次免疫后的1、2、3周，实验组脾脏和肠系膜淋巴结的Tfh细胞中IL-21的表达比例均显著高于其他三个对照组(P<0.05)，其他三个对照组之间无明显变化趋势(P>0.05)。
　　结论:
　　1.口服防龋基因疫苗pVAX1-spap/A可以诱导小鼠产生免疫应答，是一种有效的免疫途径。
　　2.小鼠体内Tfh细胞及Tfh细胞中IL-21的比例在免疫前后发生变化，提示Tfh细胞可能通过IL-21参与了防龋DNA疫苗的免疫应答反应。

目录

英文缩略词表

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分：重组质粒pVAX1-spap/A和pVAX1空载体的鉴定及大量抽提

1 材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 结论

第二部分：小鼠口服水凝胶包裹防龋DNA疫苗pVAX1-spap/A中Tfh细胞的变化研究

1 材料

2 方法

3 结果

4讨论

5结论

参考文献

综述: 基因疫苗黏膜免疫及其机制的研究进展

致谢

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