拟南芥液泡膜H-焦磷酸酶基因AVP1改良紫花苜蓿(Medicago sativa L.)抗逆性的研究

摘要

干旱和盐碱化是人类面临的世界性问题，也是制约作物和牧草产量的2个主要的环境因子。特别在我国西北干旱半干旱地区，随着水资源的日益短缺，干旱和土壤盐碱化已成为该地区的农牧业发展和生态环境的严重威胁。紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是一种优良的豆科牧草，在我国西北干旱半干旱地区农牧业生产和生态建设中发挥着极为重要的作用。然而，很多紫花苜蓿品种的耐盐、抗旱能力普遍不高，在盐渍或灌溉不足条件下种植难获高产。培育具有较强耐盐性和抗旱性的紫花苜蓿新品种，是提高西北干旱半干旱地区紫花苜蓿人工草地产量、节约灌溉以及利用大面积盐荒地的根本途径之一。传统的紫花苜蓿抗逆育种周期长，且容易受到种内抗逆基因资源的限制，基因工程技术的迅速发展为紫花苜蓿抗逆育种提供了一个新的手段。通过转基因技术培育耐盐、抗旱品种将是紫花苜蓿抗逆育种的一个重要的发展方向。液泡膜H+-pyrophosphatase(H+-PPase)已经被证明在植物离子区域化和生长素运输中有着重要的作用，其编码基因在一些模式植物和重要作物中的超表达显著提高了转基因植物的耐盐、抗旱性或耐瘠薄性，并促进了其生长发育，表明此类基因在改良紫花苜蓿的抗逆性方面具有潜在的应用价值。 在前期的研究中，我们已初步建立了农杆菌介导的紫花苜蓿栽培品种遗传转化体系，本研究对其做了进一步优化调整。为获得抗逆性强的转基因紫花苜蓿品系，本研究首先利用相关的农艺学和生理学指标，通过隶属函数法对西北地区广泛栽培的5个优良紫花苜蓿品种的耐盐性和抗旱性分别进行综合评价，筛选出具有较强耐盐性和抗旱性的材料新疆大叶苜蓿，将拟南芥液泡膜H+-PPase编码基因AVP1导入该品种，并对转基因紫花苜蓿的抗逆性进行鉴定，主要研究结果如下： 1.与无NaCI胁迫的对照相比，在200 mmol·L-1 NaCl胁迫下，5个紫花苜蓿品种的地上部干重和K+/Na+比均显著降低，叶片MDA含量和相对质膜透性均有所增加，但各指标的变化幅度因品种而异；利用上述4个指标对5个紫花苜蓿品种进行综合评价，发现它们的耐盐性由强到弱依次为：润布勒>新疆大叶>三得利>甘农3号>陇东。同样，与正常浇水的对照相比，在干旱胁迫下，紫花苜蓿各品种的地上部干重、叶片渗透势和相对含水量均显著下降，叶片相对质膜透性均显著增加，但各指标的变化幅度因品种的不同而不同；利用以上4个指标对5个紫花苜蓿品种进行综合评价，抗旱性由强到弱依次为：陇东>新疆大叶>甘农3号>三得利>润布勒。通过分析以上综合评价结果，发现新疆大叶苜蓿既有良好的耐盐性，又有较强的抗旱性，因此本研究将其选为遗传转化的种质材料，进一步改良其抗逆性。 2.在已有研究的基础上，进一步优化了农杆菌侵染方式和卡那霉素(Kan)选择方案，分别为：下胚轴在常压下用农杆菌侵染12 min；用75和40 mg·L-1 Kan分别于体胚和生根诱导的第2周开始选择抗性体胚和抗性植株。调整后的转化体系的转化效率(PCR阳性植株占侵染外植体的百分率)约为2.1％，转化周期约为19周。 3.首次用拟南芥液泡膜H+-PPase基因AVP1对新疆大叶苜蓿进行遗传转化，获得了转基因植株；PCR分析表明外源基因已经整合到紫花苜蓿基因组中；对随机抽取的8个转基因系列进行RT-PCR分析，发现AVP1基因在这些转基因系列中都能稳定表达，但其表达量在不同系列间存在差异，其中系列1最高，系列8最低。 4.对转基因紫花苜蓿的耐盐、抗旱性分析表明，AVP1的超表达增强了转基因紫花苜蓿的耐盐性和抗旱性。200 mmol·L-1 NaCl处理10 d后，野生型植株生长严重受抑，出现萎蔫、甚至死亡，而转基因植株仍然能够正常生长。自然干旱处理6d后，野生型植株开始萎蔫，而转基因植株依然正常生长，直到第8d才发生萎蔫；复水后，转基因植株解除萎蔫并恢复正常的生长发育，而野生型植株却发生永久萎蔫，最后死亡。生理测定结果表明：不论在正常生长条件，还是在盐或干旱胁迫下，转基因紫花苜蓿比野生型植株在叶和根中积累了更多的Na+、K+和Ca2+;大量的阳离子积累造成转基因植株的叶片渗透势显著低于野生型植株，使其在干旱胁迫下维持较高的叶片相对含水量。此外，在盐或水分胁迫下，转基因紫花苜蓿的叶片MDA含量和相对质膜透性均显著低于野生型植株，净光合速率和根系活力均显著高于野生植株。这些结果说明AVP1的超表达促进了转基因紫花苜蓿细胞中Na+向液泡中的区域化，并增强了细胞对其它阳离子的吸收能力。一方面可以避免盐胁迫下细胞质中过量Na+对细胞膜和各类细胞器的伤害，并稳定细胞内的离子平衡，另一方面提高细胞的渗透调节能力，使转基因紫花苜蓿能在盐或干旱胁迫下保持较多水分并维持其膨压。 5.盆栽实验表明，AVP1的超表达促进了转基因紫花苜蓿的根系增生和地上部发育。无论在正常生长条件下，还是长期处于盐或干旱环境中，转基因紫花苜蓿的生长状况总是好于野生型植株。在正常浇水条件下生长60 d(第20 d刈割1次)后，2个转基因系列的株高和地上部生物量分别比野生型植株显著高出15.5％-21.6％和27.8％-35.2％；经过较长时间盐或干旱处理后，转基因植株的以上指标同样高于野生型植株。这是因为无论在何种条件下，与野生型植株相比，AVP1转基因植株的根系更为粗壮发达、根干重和根冠比更高。发达的根系有助于转基因紫花苜蓿在胁迫条件下吸收更多的水分和养分，因而对其耐盐性和抗旱性也有着重要的贡献。 6.AVP1的超表达提高了转基因紫花苜蓿的耐瘠薄性。在缺磷(10pmol·L-1 Pi)条件下生长21d后，2个转基因系列植株的生长受抑程度比野生型植株小，其根干重、地上部干重以及根冠比分别比野生型植株显著高出54.6％-96.5％、20.7％-39.7％和23.5％-41.2％。不论有无养分胁迫，转基因植株的单株含磷量(mol·plant-1)显著高于野生型植株，分别是野生植株的1.3-1.4倍(1mmol·L-1 Pi)和1.3-1.8倍(10μmol·L-1 Pi);其单位干物质中的含磷量(mol·g-1 DW)也高于野生型植株。说明转基因紫花苜蓿吸收了更多的Pi，从而促进其生长。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章引 言

第二章国内外研究进展

1紫花苜蓿耐盐性和抗旱性研究概述

1.1紫花苜蓿的耐盐、抗旱生理研究

1.2紫花苜蓿耐盐性和抗旱性评价

2紫花苜蓿转基因研究进展

2.1紫花苜蓿转基因方法

2.2紫花苜蓿的转基因

3植物液泡膜H+-pyrophosphatase(H+-PPase)研究进展

3.1 H+-PPase蛋白的特征和分子结构

3.2 H+-PPase在生物体内的分布

3.3 H+-PPase对环境因子和外源激素的响应

3.4植物H+-PPase的主要功能

3.5 H+-PPase基因在植物中的遗传转化

第三章 紫花苜蓿栽培品种的耐盐性和抗旱性评价

1材料与方法

1.1植物材料

1.2实验处理

1.3指标的测定

1.4耐盐性和抗旱性的综合评价

1.5数据分析

2结果与分析

2.1紫花苜蓿品种耐盐性评价

2.2紫花苜蓿品种抗旱性评价

3讨论

第四章 根癌农杆菌介导拟南芥H+-PPase基因AVP1紫花苜蓿的遗传转化

1材料与方法

1.1实验材料

1.2农杆菌介导的遗传转化

1.3转基因植株的分子检测

2结果与分析

2.1转基因植株的获得和转化体系的评价

2.2转基因植株的PCR检测

2.3AVP1基因在转基因紫花苜蓿中表达的RT-PCR分析

3讨论

第五章 AVP1转基因紫花苜蓿的抗逆性检测

1材料与方法

1.1植物材料

1.2实验方案

1.3指标的测定

1.4数据分析

2结果与分析

2.1转基因紫花苜蓿耐盐性和抗旱性检测

2.2长期盐或干旱胁迫下转基因紫花苜蓿的生长发育

2.3转基因紫花苜蓿耐瘠薄性的检测

3讨论

3.1AVP1超表达与转基因紫花苜蓿的离子区域化

3.2AVP1超表达与转基因紫花苜蓿的生长发育

3.3AVP1超表达与转基因紫花苜蓿的耐瘠薄性

3.4AVP1表达水平与紫花苜蓿转基因系列的表现特征

第六章 结论

参考文献

致谢

附录