绿原酸对Aβ25-35致PC12细胞损伤的保护作用研究

摘要

目的：观察绿原酸（chlorogenic acid，CGA）对β淀粉样蛋白25-35（beta-amyloid peptides25-35，Aβ25-35）致大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(rat pheochromocytoma，PC12）细胞损伤的保护作用，并探讨其可能的机制。
　　方法：（1）传代培养PC12细胞。（2）四甲基偶氮唑盐（thiazolyl blue tetrazolium bromide, MTT）比色法检测0、2.5、5、10、20、40、80μmol/L的Aβ25-35处理24h后 PC12细胞存活率，确定构建细胞损伤模型的Aβ25-35工作浓度。（3）以不同浓度梯度的CGA作用于PC12细胞2h后，再与Aβ25-35工作浓度共孵育24h，CCK-8法检测细胞存活率，确定CGA的低、中、高干预浓度。（4）将对数生长期的PC12细胞分为正常对照(Control)组、模型（Model）组及CGA组，其中CGA组为低、中、高三个浓度分别作用细胞2h后，再加入Aβ25-35工作浓度，孵育24h后检测各项指标。罗丹明123（Rhodamine123）荧光染色法检测线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential， MMP）；2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）荧光法检测细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）；流式细胞术检测细胞凋亡率；比色法检测细胞内丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力；Western blot法检测细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（ cysteine-containing aspartate specific proteases-3， Caspase-3）、核转录因子κB（ nuclear factor kappa B， NF-κB）、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）的表达；ELISA法检测各组细胞肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）含量。
　　结果：（1）与0μmol/L Aβ25-35处理组比较，其余各组PC12细胞存活率下降，与Aβ25-35浓度呈负相关，差异有统计学意义（P<0.05，r=0.980）。其中，20μmol/L Aβ25-35组PC12细胞存活率为51.96±2.08％，故采用此Aβ25-35浓度构建PC12细胞损伤模型。（2）与Model组（49.00±0.02%）相比，12.5、25、50、100、200μmol/L CGA组PC12细胞存活率升高，差异有统计学意义（P<0.05），其中50μmol/L CGA组细胞存活率（83.37±0.01%）升高最为明显。因此，将CGA的低、中、高三个浓度分别确定为25、50、100μmol/L。（3）Rhodamine123及DCFH-DA法检测MMP及ROS，倒置荧光显微镜下观察显示，Control组PC12细胞胞体呈锥形或椭圆形，荧光暗；Model组PC12细胞聚集成团，荧光增强，说明MMP耗散及ROS产生增加；与Model组比较，CGA组PC12细胞荧光强度减低，说明MMP耗散及ROS产生减少。（4）流式细胞术结果显示，与Control组（2.00±0.02%）比较，Model组PC12细胞凋亡率（29.31±0.02%）升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与Model组比较，CGA组PC12细胞凋亡率(26.10±0.02%，16.07±0.02%，22.67±0.02%)下降，差异有统计学意义（P<0.05）。（5）比色法检测结果显示，与 Control组比较，Model组细胞内 SOD、GSH-Px活力降低，MDA水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与Model组比较， CGA组细胞内SOD、GSH-Px活力升高，MDA水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）。（6）Western blot结果显示，与Control组Caspase-3（0.10±0.00），NF-κB（0.38±0.00）， IL-1β（0.16±0.00）比较，Model组PC12细胞Caspase-3（1.29±0.00）、NF-κB（0.55±0.00）、IL-1β（0.23±0.01）表达水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与 Model组比较， CGA组PC12细胞Caspase-3（1.07±0.01，0.58±0.01，0.52±0.02）、NF-κB（0.55±0.02，0.48±0.02，0.49±0.01）、IL-1β（0.22±0.01，0.18±0.01，0.20±0.01）蛋白表达水平下降，差异有统计学意义（P<0.05）。(7) ELISA检测结果显示，与Control组（553.44±12.76 pg/mL）比较，Model组（872.19±1.62 pg/mL） TNF-α浓度升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与Model组比较，CGA组TNF-α浓度（840.94±12.76、731.56±11.80、778.44±7.31 pg/mL）下降，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　结论：（1）Aβ25-35可致PC12细胞存活率下降，对PC12细胞有损伤作用。（2）CGA能提高Aβ25-35处理的PC12细胞的存活率，降低细胞凋亡率，对Aβ25-35致PC12细胞损伤有保护作用。（3）CGA可减少Aβ25-35处理的PC12细胞内ROS和MDA水平，增加SOD及GSH-Px活力，降低细胞凋亡率，减轻Aβ25-35致PC12细胞氧化损伤。（4） CGA可减少Aβ25-35处理的PC12细胞内TNF-α和IL-1β的表达，抑制NF-κB及其信号通路，降低细胞凋亡率，减轻Aβ25-35致PC12细胞炎症损伤。

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前言

1 材料

1.1 PC12细胞购于中国科学研究院上海生命科学研究所。

1.2 主要实验仪器

1 .3 主要实验试剂

1.4 实验试剂的配制

2 实验方法

2.1 细胞复苏

2.2 细胞传代

2.3 MTT比色法确定构建细胞损伤模型的Aβ25-35浓度

2.4 CGA低、中、高剂量的确定及PC12细胞的实验分组

2.5 罗丹明123荧光染色法检测细胞线粒体膜电位

2.6 2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐荧光法检测细胞ROS水平

2.7 流式细胞术检测细胞凋亡率

2.8 比色法检测细胞内SOD、GSH-Px活力及MDA含量

2.9 Western blot法检测细胞Caspase-3、NF-κB、IL-1β的表达

2.10 ELISA测定细胞内TNF-α的浓度

2.11 统计学分析

3．结果

3.1 Aβ25-35对PC12细胞存活率的影响

3.2 CGA对Aβ25-35处理的PC12细胞存活率的影响

3.3 CGA对细胞线粒体膜电位耗散的影响

3.4 CGA对细胞内活性氧水平的影响

3.5 CGA对细胞凋亡率的影响

3.6 CGA对细胞内SOD、GSH-Px活力及MDA含量的影响

3.7 CGA对细胞内Caspase-3、IL-1β及NF-κB表达的影响

3.8 CGA对细胞内TNF-α浓度的影响

4 讨论

4.1 细胞损伤模型的构建

4.2 CGA对Aβ25-35致PC12细胞损伤保护作用的可能机制

4.3 展望

5 结论

参考文献

综述: 阿尔茨海默病中的氧化应激及抗氧化治疗

致谢

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